Identifikation von Ziel-mRNAs der microRNA miR-142

Abstract

In den 1990er Jahren wurde die posttranskriptionelle Regulation der Genexpression durch nicht-kodierende RNA-Moleküle beschrieben. Diese sogenannten microRNAs (miRNAs) sind seitdem Gegenstand intensiver Forschung, insbesondere im Zusammenhang mit menschlichen (Tumor-) Erkrankungen und können als Onkogene und Tumorsuppressoren agieren. Der miRNA precursor von ca. 80 Nukleotiden (nt) wird zu zwei funktionellen reifen 3p- und 5p-Fragmenten prozessiert, die mit ihrer „Seed“-Sequenz an die 3‘ untranslatierte Region (3’UTR) ihrer Ziel messenger RNA (mRNA) binden und hierdurch die Proteinsynthese verringern. Anhand mehrerer Publikationen war ersichtlich, dass die miR-142 in vielen malignen Erkrankungen erniedrigt ist. Weiterhin war bekannt, dass das miR-142 Gen in diffus großzelligen B-Zell Lymphomen (DLBCL= diffuse large B cell lymphoma) sowie in akuten myeloischen Leukämien (AML) von Mutationen betroffen ist, die u.a. die „Seed“-Sequenz von miR-142-3p und -5p betreffen. Ziel dieser Dissertation war es Targets der miR-142-3p und miR-142-5p, welche über die PAR-CLIP-Methode identifiziert worden waren, experimentell zu bestätigen. Zu diesen Targets gehörten MORF4L2, AKT1S1 sowie TSPAN3, welche mit verschiedenen malignen Erkrankungen in Verbindung gebracht werden können. Die Amplifikation dieser Targets erfolgte initial aus Testis cDNA, abschließend erfolgte die Klonierung in den pMIR-Vektor, mithilfe dessen mRNA/miR-142-Interaktionen anhand von Luciferase-Assays bestätigt werden konnten. Neben der miR-142 wurden miR-142 Mutanten, welche durch ihre Mutation in der 3p oder 5p „Seed“-Sequenz ihre Fähigkeit zur spezifischen Interaktion verloren haben, verwendet. Hierdurch sollte bestätigt werden, dass eine Aussage über die mRNA/miRNA-Interaktion möglich ist, ohne vorher die Bindestelle in der 3´UTR zu mutieren. Im zweiten Teil der Arbeit erfolgte die Mutation der Bindestellen im Target, sowohl MORF4L2 als auch AKT1S1 stellten sich als Target für die miR-142-3p dar. Eine Interaktion mit MORF4L2 war, nach Mutation der Bindestelle in der 3´UTR, nicht mehr nachweisbar. Bei AKT1S1, welche zwei potentielle Bindestellen aufwies, konnte nach Mutation der Bindestelle mit der höheren Affinität zur miRNA, keine Interaktion mehr nachgewiesen werden.

Eine Besonderheit stellte das TSPAN3 dar, welches als einziges ein 5p-Target darstellte. Hier konnte trotz Mutation der vorhergesagten Bindestelle eine anhaltende Interaktion dargestellt werden. Innerhalb eines Fragments von 270 nt konnte auch nach Mutation der potentiellen 5p-Bindestelle eine Interaktion weiterhin nachgewiesen werden. Dieses Ergebnis lässt sich nur durch das Vorhandensein einer weiteren nicht identifizierten 5p- Bindestelle erklären.

Post-transcriptional regulation of gene expression by so-called microRNAs was identified in the early 1990’s. Since their discovery, the function of miRNAs has been the subject of intense research, in particular in respect to their role in human disease. MiRNAs have been assigned various functions in biological processes; in particular, some are considered to represent either tumour suppressors or oncogenes. The miRNA precursor of about 80nt is further processed into a 3’ and a 5’ miRNA which target with their "seed"-sequence the 3’ untranslated region (“3’UTR”) of messenger RNAs (mRNAs) and down-regulate their protein synthesis. Specific miRNAs have been implicated in the formation of certain malignant tumours. Various publications have shown that miRNA miR-142 is down-regulated in a variety of different tumours. Further, the miR-142 gene has been shown to harbour mutations in diffuse B-cell lymphoma (DLBCL) and acute myeloid leukaemia (AML) which affects the mature 3’ and 5’ miRNAs and most likely inactivate their functionality. The goal of this dissertation was the experimental confirmation of targets of miR-142-3p and miR-142-5p that were predicted by the “PAR-CLIP” method. The targets that were analysed in detail were the mRNAs of the MORF4L2, AKT1S1 and TSPAN3 genes which had been found to be associated with various human diseases. The amplification of the target sequences within the 3’ untranslated regions (“3’UTR”) was carried out using human testis cDNA libraries. The PCR products were inserted into the reporter vector pMIR. The regulation of the different 3’UTRs within pMIR were then assayed by co-transfection of expression vectors for miR-142-wt or different miR-142 mutants that harbour mutations in their so-called “seed-sequence”. The idea of this procedure was to show that the use of these mutants abolished the need to mutate the respective target sequence within the mRNA. In addition, the target sequences were mutated in the cloned 3’UTRs to demonstrate that they are valid targets for miR-142. It was demonstrated that MORF4L2 and AKT1S1 were indeed targets for miR-142-3p. We found that MORF4L2 had one binding site for miR-142-3p, while only one of two potential binding sites in the AKT1S1 3’UTR was a target for miR-142-3p. For the TSPAN3 mRNA, which is a potential target of miR-142-5p, the results were ambiguous. After mutation of the predicted target sequence within a fragment of 270 nt, the reporter was still responsive to miR-142. The results could be explained by the presence of an additional non-identified miR-142-5p binding site.