Bitte benutzen Sie diese Referenz, um auf diese Ressource zu verweisen: doi:10.22028/D291-32037
Titel: Synthesis, endogenous detection, and mitochondrial function of the hydroxy-substituted Coenzyme Q10 derivative HO-Q10
VerfasserIn: Slowik, Ewa
Sprache: Englisch
Erscheinungsjahr: 2019
Erscheinungsort: Homburg/Saar
Kontrollierte Schlagwörter: Ubidecarenon
Derivate
Wichtigkeit
Physiologie
Synthese
Detektion
DDC-Sachgruppe: 570 Biowissenschaften, Biologie
610 Medizin, Gesundheit
Dokumenttyp: Dissertation
Abstract: Quinones are redox-active molecules playing important roles in all organisms. In humans, the para-benzoquinone derivative Coenzyme Q10 (CoQ10) carrying a chain of 10 isoprene units and two neighbouring methoxy groups at the benzoquinone ring is found ubiquitously. It is an essential electron and proton transporter in the mitochondrial respiratory chain and fulfils various important functions like regulating redox homeostasis and membrane viscosity. In 2011, Bogeski et al. chemically modified the functional head group of CoQ10 exchanging one methoxy group by a hydroxy group. The hydroxy analogue can also be produced by CYP450 present in mitochondria and endoplasmic reticulum and is a postulated intermediate in CoQ biosynthesis that had not been detected in eukaryotes. The aim of this thesis was to gain first insights into the biological role of the mono-demethylated Coenzyme Q10. Therefore, within this study and my precedent master thesis, the CoQ10 derivative, HO-CoQ10, was synthesized and purified in sufficient amounts for the first time. Its structure could be verified using mass spectrometry and 1H/13C 2-dimensional nuclear magnetic resonance spectroscopy. The synthesis was confirmed to always produce a constitutional isomer mixture of HO-CoQ10 modified at the 2- or 3-position of the quinone ring. Due to the high lipophilicity mediated by the long isoprene chain, reliable transition to the aqueous phase was crucial for experiments. An ethanolic solution of 1 mM CoQ10 and 5 mM HO-CoQ10 was stable at room temperature and could be diluted in aqueous media. Hence, most experiments were conducted with 1% ethanol resulting in a maximal concentration of 10 μM CoQ10. To understand the physiological importance of HO-CoQ10, its endogenous occurrence was clarified using ultra-high-pressure liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry. In isopropanol extracts from crude bovine heart mitochondria, HO-CoQ10 was detected for the first time and estimated to have a concentration of 100 μM in mitochondrial membranes. Evaluating toxicity of exogenously applied HO-CoQ10, no effect on cancer cell lines cultivated under standard cell culture conditions was found: No interference with metabolic activity and proliferation was observed in HeLa, MelJuso and Jurkat T cells using the CellTiter-Blue® reduction assay and apoptosis was not induced in Jurkat T cells analysing caspase activity using Caper-GR sensor. Detecting HO-CoQ10 in mitochondria and considering the essential role of CoQ10 in the electron transport chain, its influence on respiration was evaluated measuring oxygen consumption of isolated cardiac mitochondria from BL6N mice using a Clark-type electrode. HO-CoQ10 inhibited Complex I-, II-, and III-linked respiration. Surprisingly, also the native substance CoQ10 intervened with Complex I- and II-linked respiration, but to a lower extent than HO-CoQ10. Extramitochondrial calcium enhanced inhibition via CoQ10 and HO-CoQ10 by the same factor. Since respiration buffers contained inorganic phosphate affecting free metal concentrations, free calcium was defined using the fluorescent calcium indicator fura-2. Photometric activity assays of respiratory chain enzymes from bovine heart mitochondria showed that HO-CoQ10 but not CoQ10 inhibited both oxidoreductase activity of Complex I and II. Decyl-ubiquinol:cytochrome c oxidoreductase (Complex III) was unaffected. In-gel activity staining of Complex I and II did not show interference on oxidase activities indicating that HO-CoQ10 acts on Q-binding sites of the complexes. Since CoQ10 is an important antioxidant in vivo but also shows prooxidant activity under distinct circumstances depending on its redox state, H2O2 production in the supernatant of coupled mouse heart mitochondria was examined using an HRP-based assay with Amplex® UltraRed. HO-CoQ10 increased Complex I- and II-linked ROS (reactive oxygen species) formation rate. CI-linked rates were similar for HO-CoQ10 and the ubiquinone- binding site inhibitor rotenone. In contrast, production rates induced by the Qi-site inhibitor of Complex III, antimycin A, were considerably higher suggesting a distinct mechanism of ROS formation. Glycerol dehydrogenase-linked H2O2 production was increased by antimycin A and slightly reduced by HO-CoQ10. To assess the correlation of respiration and ROS production, oxygen consumption and superoxide production were detected simultaneously by electron spin resonance spectroscopy with the oxygen sensor trityl and the spin probe for superoxide CMH. Similar to rotenone, CM• formation rate was not influenced by HO-CoQ10. Electron distribution in Complex I-associated iron-sulphur clusters of NADH-energized bovine heart mitochondria, visualised with low-temperature electron spin resonance spectroscopy, was not altered by HO- CoQ10. This work provides the first insight into the biological significance of the neglected hydroxy analogue of CoQ10. Focussing on mitochondrial respiration, the most studied and biologically important role of Coenzyme Q, it was found that both CoQ10 and HO-CoQ10 inhibit respiration. Enrichment of the substances was shown to decrease membrane fluidity in other studies, which might be the underlying mechanism diminishing electron transfer efficiency. Calcium potentiating the inhibition by both substances supports the observation that HO-CoQ10 as well as CoQ10 are able to bind calcium. Due to its lower redox potential, HO-CoQ10 has been predicted to be a more potent antioxidant with a potential to substitute CoQ10 in the medication of ROS related diseases. However, it was found to inhibit activity of respiratory chain complexes and stimulated ROS production most likely via blocking Q-binding sites. Downregulation of respiration and stimulation of ROS production by HO-CoQ10, found in small portions in metabolic active heart tissue, suggests a role in regulation of energy metabolism and might act as an internal brake for growth when synthesis is upregulated.
Synthese, endogene Detektion und mitochondriale Funktion des hydroxy-substituierten Coenzym Q10-Derivats HO-CoQ10: Chinone sind redoxaktive Moleküle, die in allen Organismen wichtige Aufgaben erfüllen. Im Menschen ist das para-Benzochinon-Derivat Coenzym Q10 (CoQ10) ubiquitär vorhanden. Am Chinonring trägt es zwei benachbarte Methoxygruppen und eine Seitekette aus zehn Isopren-Einheiten. CoQ10 ist ein essentieller Elektronen- und Protonentransporter der mitochondrialen Atmungskette und an anderen wichtigen Funktionen wie der Regulation der Redoxhomoöstase und Membranviskosität beteiligt. 2011 haben Bogeski et al. seine funktionelle Kopfgruppe chemisch modifiziert, indem sie eine der Methoxygruppen durch eine Hydroxygruppe substituiert haben. Das Hydroxy-Analogon kann auch durch CYP450-Enzyme, welche in Mitochondrien und endoplasmatischem Retikulum exprimiert sind, produziert werden und ist eine postulierte biosysnthetische Vorstufe von Coenzyme Q, die jedoch in Eukaryoten bisher nicht nachgewiesen werden konnte. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals die biologische Funktion von mono-demethyliertem Coenzym Q10 untersucht. Hierzu wurde das Coenzym Q10-Derivat, HO-CoQ10, im Rahmen dieser Doktorarbeit und der vorangehenden Masterarbeit synthetisiert und in ausreichender Menge aufgereinigt. Die Struktur wurde mittels 1H/13C 2-dimensionaler Kernspinresonanzspektroskopie verifiziert. Das Produkt besteht aus einer Mischung an Konstitutionsisomeren, welche die Hydroxygruppe an Position 2 oder 3 des Chinonrings tragen. Aufgrund der langen Isoprenkette handelt es sich um stark liphophile Substanzen, deren Übergang ins Wässrige für die folgenden Untersuchungen essentiell war. 1 mM CoQ10 und 5 mM HO-CoQ10 in ethanolischer Lösung waren bei Raumtemperatur stabil und konnten in wässrigen Medien verdünnt werden. Deshalb wurden die meisten Experimente mit 1 % Ethanol und einer maximalen CoQ10 Konzentration von 10 μM durchgeführt. Um die physiologische Bedeutung von HO-CoQ10 zu erfassen, wurde sein endogenes Vorkommen mittels Ultra-Hochdruckflüssigkeitschromatographie-gekoppelter Massenspektrometrie aufgeklärt. In Isopropanol- Extrakten aus unaufbereitetetn Rinderherzmitochondrien wurde HO-CoQ10 erstmals nachgewiesen und seine Konzentration in der Mitochondrienmembran auf 100 μM geschätzt. Die Toxizität von exogen appliziertem HO-CoQ10 auf unter Standard-Zellkulturbedingungen kultivierten Krebszelllinien wurde untersucht: Die metabolische Aktivität und Proliferation von HeLa, MelJuso und Jurkat T-Zellen, bestimmt mit Hilfe des CellTiter-Blue®-Reduktionsassays, war unbeeinträchtigt. Zudem konnte in Jurkat T-Zellen bei Analyse der Caspase-Aktivität mittels des Casper-GR-Sensors keine Apoptoseinduktion beobachtet werden. Da HO-CoQ10 in Mitochondrien detektiert wurde und CoQ10 eine essentielle Rolle in der Elektronentransportkette einnimmt, wurde der Einfluss auf die Respiration untersucht. Hierfür wurde der Sauerstoffverbrauch isolierter Herzmitochondrien aus BL6N-Mäusen mit Hilfe einer Clark-Elektrode gemessen. HO-CoQ10 inhibierte Complex I-, II- und III-assoziierte Atmung. Erstaunlicherweise inhibierte auch die native Substanz CoQ10 die Complex I- und II-assoziierte Respiration; dies jedoch in einem geringeren Ausmaß als HO-CoQ10. Extramitochondriales Calcium steigerte die durch CoQ10 und HO-CoQ10 vermittelte Inhibition gleichermaßen. Die Puffer für Atmungsmessungen enthalten anorganisches Phosphat, welches sich auf die Konzentration an freien Metallionen auswirkt. Deswegen musste die freie Calicumkonzentration mittels des fluoreszenten Calciumindikators Fura-2 festgelegt und -gestellt werden. Photometrische Aktivitätsbestimmungen der Atmungskettenenzyme aus Rinderherzmitochondrien zeigten, dass HO-CoQ10, jedoch nicht CoQ10 Complex I- und Complex II-Oxidoreduktase-Aktivität inhibiert. Decyl-ubichinol:Cytochrom c oxidoreduktase (Complex III) war unbeeinträchtigt. In-Gel-Aktivitätsfärbungen stellten heraus, dass HO- CoQ10 keinen Einfluss auf die Oxidase-Aktivität von Complex I und Complex II hat. Dies deutet darauf hin, dass HO-CoQ10 auf die Q-Bindestellen wirkt. Da CoQ10 ein in-vivo wichtiges Antioxidans ist, das unter bestimmten Umständen abhängig vom Redoxzustand prooxidativ wirkt, wurde die H2O2-Produktion im Überstand gekoppelter Mausherzmitochondrien mit Hilfe eines HRP-basierten Assays mit Amplex® UltraRed untersucht. HO-CoQ10 erhöhte die Complex I- und Complex II-assoziierte Produktionsrate an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS). CI-assoziierte Raten mit HO-CoQ10 waren vergleichbar mit Raten in Anwesenheit des Ubichinon- Bindestellen-Inhibitors Rotenon. Im Gegensatz dazu zeigten Experimente mit dem Qi-Bindestellen-Inhibitor von Complex III, Antimycin A, deutlich höhere Produktionsraten und weisen damit auf einen anderen Mechanismus der ROS-Produktion hin. Glyceroldehydrogenase-assoziierte H2O2-Produktion war durch Antimycin A erhöht und durch HO-CoQ10 leicht reduziert. Um den Zusammenhang von Respiration und ROS- Produktion zu untersuchen, wurden Sauerstoffverbrauch und Superoxidproduktion simultan mitttels Elektronenspinresonsanzspektroskopie mit dem Sauerstoffsensor Trityl und der Superoxid-Spinsonde CMH gemessen. Vergleichbar mit Rotenon wurde die CM•-Bildungsrate auch von HO-CoQ10 nicht beeinflusst. Die Elektronenverteilung in Eisen-Schwefel-Clustern von Complex I in NADH-energetisierten Rinderherzmitochondrien wurde mittels Tieftemperatur-Elektronenspinresonanzspektroskopie visualisiert und war nicht durch HO-CoQ10 verändert. Die vorliegende Arbeit gibt erste Hinweise auf die biologische Bedeutung des wenig beachteten Hydroxy-Analogons von CoQ10. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl CoQ10 als auch HO-CoQ10 die mitochondriale Atmung inhibieren. Da andere Studien zeigten, dass die Anreicherung der Substanzen die Fluidität der Membran reduziert, könnte dies der zugrunde liegende Mechanismus für eine Abnahme der Elektronentransfereffizienz sein. Die Potenzierung der Inhibition durch Calcium unterstützt die Beobachtung, dass HO-CoQ10 und CoQ10 die Fähigkeit besitzen Calcium zu binden. Aufgrund des niedrigeren Redoxpotentials wurde prognostiziert, dass HO-CoQ10 ein effektiveres Antioxidans ist und das Potential besitzt, CoQ10 in der medizinischen Behandlung von ROS-korrelierten Krankheiten zu ersetzen. Allerdings zeigte sich, dass HO-CoQ10, höchstwahrscheinlich durch die Blockade von Q-Bindestellen, Atmungskettenkomplexe hemmt und ROS-Produktion stimuliert. Herunterregulation der Respiration und Stimulation von ROS-Produktion durch HO-CoQ10, das in stoffwechselaktivem Herzgewebe in kleinen Mengen gefunden wurde, weist auf Beteiligung in der Regulation von Energiestoffwechsel hin und könnte bei Hochregulation der Synthese als interne Wachstumsbremse agieren.
Link zu diesem Datensatz: urn:nbn:de:bsz:291--ds-320379
hdl:20.500.11880/30895
http://dx.doi.org/10.22028/D291-32037
Erstgutachter: Hoth, Markus
Tag der mündlichen Prüfung: 25-Mai-2020
Datum des Eintrags: 16-Mär-2021
Fakultät: M - Medizinische Fakultät
Fachrichtung: M - Biophysik
Professur: M - Prof. Dr. Markus Hoth
Sammlung:SciDok - Der Wissenschaftsserver der Universität des Saarlandes

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