Metabolische Aktivierung isolierter mikrovaskulärer Fragmente aus Fettgewebe für das Tissue Engineering

Abstract

Das Ziel des Tissue Engineerings ist die Herstellung autologer Ersatzgewebe. Zu diesem Zweck werden patienteneigene Zellen auf Trägermatrices, sogenannte Scaffolds, gesiedelt und in entsprechende Gewebedefekte implantiert. Um die transferierten Zellen im Anschluss mit Sauerstoff und Nährstoffen zu versorgen, ist eine schnelle und adäquate Vaskularisierung von wesentlicher Bedeutung. Eine reine Vaskularisierung über das Einwachsen neuer Blutgefäße aus dem umliegenden Empfängergewebe ist jedoch ein langwieriger Vorgang. Daher wurde in den letzten Jahren das Konzept der Prävaskularisierung von Scaffolds mittels adipösen mikrovaskulären Fragmenten etabliert. Diese verbinden sich kurz nach Implantation über den Prozess der Inoskulation mit dem vaskulären System des Empfängergewebes, was die Vaskularisierung von Scaffolds erheblich beschleunigt. Trotz ihres hervorragenden Vaskularisierungspotentials dauert der Zusammenschluss mikrovaskulärer Fragmente zu einem neuen Gefäßnetzwerk in vivo immer noch einige Tage. In der vorliegenden Arbeit wurden daher Strategien untersucht, die zur Beschleunigung dieses Prozesses beitragen können. Vergangene Studien zeigten, dass metabolische Signale, wie Insulin, pro-angiogene Signalkaskaden im Fettgewebe initiieren. Insbesondere die Ausschüttung von Insulin-like Growth Factor (IGF)-1 aus Adipozyten spielt hierbei eine wichtige Rolle. Daher wurde im ersten Studienabschnitt der vorliegenden Arbeit untersucht, ob Insulin zu einer gesteigerten Vaskularisierungskapazität mikrovaskulärer Fragmente führt und inwiefern dieser potentielle Effekt über IGF-1 vermittelt wird. Hierfür wurden aus dem Nebenhodenfettgewebe von Spendermäusen mikrovaskuläre Fragmente isoliert und für 24 h bei 4 °C in University of Wisconsin- (UW) Lösung kultiviert. Die UW-Lösung war entweder mit Vehikel, Insulin oder einer Kombination aus Insulin und Insulin-like Growth Factor-Binding Protein (IGFbp) 4 supplementiert. Im Anschluss wurden die mikrovaskulären Fragmente auf Integra®-Scaffolds gesiedelt und in die Rückenhautkammern von C57BL/6 Mäusen implantiert. Die Vaskularisierung der implantierten Scaffolds wurde über einen 14-tägigen Untersuchungszeitraum mittels intravitaler Fluoreszenzmikroskopie sowie histologischer und immunhistochemischer Färbungen analysiert. Die Stimulation mikrovaskulärer Fragmente mit Insulin führte zu erhöhten Blutzellgeschwindigkeiten und Scherraten in den sich entwickelnden Gefäßnetzwerken sowie zu einer höheren Gefäßdichte im Randbereich der Integra®-Scaffolds. Die Implantate mit den Insulin-behandelten mikrovaskulären Fragmenten wurden demzufolge auch besser in das Empfängergewebe inkorporiert. Im Zentrum der Scaffolds ließ sich jedoch lediglich eine marginal gesteigerte Gefäßdichte gegenüber den anderen beiden Gruppen nachweisen. Sämtliche Insulin-vermittelten Effekte konnten durch Zugabe von IGFbp4 blockiert werden. Zusammenfassend konnte somit erstmals gezeigt werden, dass die Kultivierung mit Insulin zu einer IGF-1-vermittelten Steigerung des Angiogenesepotentials mikrovaskulärer Fragmente führt. Insbesondere aus der Diabetesforschung sind für hohe Glukosekonzentrationen pro-angiogene Effekte bekannt. Aus diesem Grund wurde im zweiten Studienabschnitt der vorliegenden Arbeit untersucht, ob die Stimulation mit hochkonzentrierter Glukose die Vaskularisierungskapazität mikrovaskulärer Fragmente steigert. Hierzu wurden die mikrovaskulären Fragmente für 24 h in UW-Lösung, die mit Vehikel oder 30 mM Glukose supplementiert war, kultiviert. Nach deren Transfer auf Integra®-Scaffolds erfolgte die Implantation in die Rückenhautkammern von C57BL/6 Mäusen. Analog zum ersten Teil der Arbeit wurde mittels intravitaler Fluoreszenzmikroskopie, Histologie und Immunhistochemie die Vaskularisierung der Implantate analysiert. Darüber hinaus wurde in vitro die Morphologie der mikrovaskulären Fragmente mittels Rasterelektronenmikroskopie sowie die Expression angiogener Faktoren mittels eines Proteom-Profiler-Maus-Angiogenese-Arrays untersucht. Die Stimulation mit hochkonzentrierter Glukose führte zu einer gesteigerten Proliferation der Endothelzellen und perivaskulären Zellen der mikrovaskulären Fragmente. Außerdem konnte eine verbesserte Zellviabilität sowie eine erhöhte Expression pro-angiogener Proteine in Glukose-exponierten, mikrovaskulären Fragmenten nachgewiesen werden. Dies führte in vivo zu einer verbesserten Vaskularisierung und Gefäßnetzwerk-Ausreifung im Vergleich zu Kontrollen. Somit kann geschlussfolgert werden, dass hochkonzentrierte Glukose das Angiogenese-potential mikrovaskulärer Fragmente erheblich steigert, was in Zukunft wesentlich zur Verbesserung der Vaskularisierung von Scaffolds im Bereich des Tissue Engineerings eingesetzt werden könnte.

The aim of tissue engineering is the generation of autologous tissue substitutes. For this purpose, the patient’s own cells are seeded onto carrier matrices, also referred to as scaffolds, which are implanted into corresponding tissue defects. In order to subsequently supply the transferred cells with oxygen and nutrients, a rapid and adequate vascularization is of major importance. However, the angiogenesis-driven vascularization via the ingrowth of new blood vessels from the surrounding host tissue is a time-consuming process. Thus, the concept of prevascularization of scaffolds with adipose tissue-derived microvascular fragments has been established in recent years. Shortly after implantation, they interconnect through the process of inosculation with the vascular system of the recipient tissue, which markedly accelerates the overall process of vascularization of scaffolds. Despite their excellent vascularization potential, the in vivo reassembly of microvascular fragments into a blood-perfused microvascular network still requires several days. Hence, new strategies that may accelerate this process have been investigated in the present thesis. Recent studies indicate that metabolic signals, such as insulin, initiate pro-angiogenic signaling cascades in adipose tissue. In particular, the release of insulin-like growth factor (IGF)-1 from adipocytes is thought to play a major role in this context. Therefore, the first part of the present thesis examined whether insulin leads to an increased vascularization capacity of microvascular fragments and whether this effect is mediated by IGF-1. For this purpose, microvascular fragments were isolated from the epididymal fat pads of donor mice and cultivated for 24 h in 4 °C University of Wisconsin (UW) solution. The UW solution was either supplemented with vehicle, insulin or a combination of insulin and insulin-like growth factor-binding protein (IGFbp) 4. Subsequently, the microvascular fragments were seeded onto Integra® scaffolds and implanted into dorsal skinfold chambers of C57BL/6 mice. The vascularization of the implanted scaffolds was analyzed over a 14-day observation period by means of intravital fluorescence microscopy as well as histological and immunohistochemical stainings. The stimulation of microvascular fragments with insulin increased centerline red blood cell velocities and wall shear rates in the developing microvascular networks as well as the microvessel density in the border zones of the Integra® scaffolds. In line with this, the insulin treatment of the microvascular fragments resulted in an improved incorporation of the implants into the host tissue. However, only a slightly increased microvessel density could be detected in the center of the scaffolds when compared to the other two groups. All insulin-mediated effects were blocked by the addition of IGFbp4. Taken together, these findings demonstrate that cultivation with insulin results in an IGF-1-mediated increase of the angiogenic potential of microvascular fragments. It is well known that high glucose concentrations exert pro-angiogenic effects. Therefore, the second part of the present thesis investigated whether the stimulation with high glucose increases the vascularization capacity of microvascular fragments. For this purpose, microvascular fragments were cultivated for 24 h in UW solution supplemented with vehicle or 30 mM glucose. Thereafter, they were transferred onto Integra® scaffolds, which were implanted into dorsal skinfold chambers of C57BL/6 mice. As in the first part of this thesis, the implants’ vascularization was analyzed by means of intravital fluorescence microscopy, histology and immunohistochemistry. Moreover, the morphology of microvascular fragments was investigated in vitro by means of scanning electron microscopy and their expression of angiogenic factors was examined by means of a proteome profiler mouse angiogenesis array. Stimulation with high glucose increased the proliferation of endothelial and perivascular cells within microvascular fragments. Furthermore, glucose-exposed microvascular fragments exhibited an improved cell viability as well as a higher expression of pro-angiogenic proteins. In vivo, this resulted in an enhanced vascularization and microvascular network maturation when compared to controls. Hence, it can be concluded that stimulation with high glucose significantly increases the angiogenic potential of microvascular fragments. Therefore, glucose treatment may represent a new approach to essentially improve the vascularization of scaffolds in future tissue engineering applications.