Novel functions of the calcium channel β3 subunit

Abstract

The Ca2+ channel β subunits (Cavβs) 1, 2, 3 and 4 are essential for trafficking the poreforming Cavα1 subunit to the plasma membrane and for modulation of Ca2+ currents. We identified the Cavβ3 protein in embryonic fibroblasts (MEFs) isolated from wildtype mice but we did not detect any functional depolarization-induced Ca2+ influx into these cells. Subcellular fractionation and confocal imaging of MEFs and Cavβ3 cDNA expressing HEK293 and Cos-7 cells reveal a localization of Cavβ3 all over the cytoplasm even when the Cav1.2 cDNA had been co-expressed. Fura-2 measurements during agonist-induced IP3 generation and flash photolysis of cagedIP3 show that IP3-dependent Ca2+ release was significantly increased in β3-deficient MEFs compared to wild-type cells. Vice versa, expression of Cavβ3 cDNA in cells which hardly express Cavβ3 gene endogenously like Cos-7 cells and HEK293 cells decreases significantly the IP3-dependent Ca2+ release. Using the anti-Cavβ3 antibody, the Cavβ3 protein was precipitated, and among the proteins associated with the retained Cavβ3 were the IP3R and vice versa. Cavβs contain two conserved regions, C1 and C2, essential for Cav channel regulation, which share homology with Src homology (SH) 3 domains (C1) and guanylate kinase (GK, C2). Results obtained with SH3- and GK-deficient and plasma-membrane targeted β3-protein show that i) the SH3-domain and ii) the localization within the cytoplasm are required for Cavβ3- IP3R interaction and for the β3-dependent decrease of agonist-induced Ca2+ release. Using glutathione S-transferase-pull-down experiment two novel binding sites for Cavβ3 protein were mapped to amino acid residues 346-917 and 1387-2249 of the IP3R type 3. MEFs obtained from Cavβ3-deficient mice revealed significant differences in migration compared to wild-type cells. By transferring this behavior into an in vivo integrative pathophysiological response we studied skin wound healing which occurred significantly faster in β3-deficient mice than in wild-type mice. In summary, we discovered a novel Cav-independent function of the Cavβ3 protein, which desensitizes cells to low IP3 concentrations apparently by interacting with the internal coupling domain of IP3R via its SH3 domain. This novel Cavβ3 function has a significant impact on fibroblasts migration in vitro and skin wound closure in vivo.

Die β Untereinheiten Spannungs-aktivierter Kalzium (Ca2+) Kanäle, Cavβ 1, 2, 3 und 4, sind verantwortlich für den Transport der Poren-bildenden Cavα1 Untereinheit zur Plasmamembran und sie beeinflussen die Kinetik der Ca2+ -Ströme. In primären embryonalen Fibroblasten der Maus (MEFs) konnten wir Cavβ3 identifizieren, aber nach Depolarisation war kein Ca2+ -Einstrom in diesen Zellen zu detektieren. Subzelluläre Fraktionierung und konfokale Fluoreszenzaufnahmen der Fibroblasten und von Cavβ3 cDNA exprimierenden HEK293 und Cos-7 Zellen zeigen eine Lokalisation von Cavβ3 in Zytoplasma auch nach Koexpression der Cavα1.2 cDNA. Fura-2 Messungen während einer Agonisten-induzierten IP3 Bildung und FlashPhotolyse von „caged“ IP3 ergaben, dass β3-defiziente Fibroblasten im Vergleich zu Wildtyp Zellen eine signifikant erhöhte IP3-abhängige Ca2+ -Freisetzung aufweisen. Andererseits führt die Expression von Cavβ3 cDNA in Cos-7 und HEK293 Zellen, Zellen, die das Cavβ3 gen normalerweise nicht (Cos-7) oder nur sehr schwach exprimieren (HEK293), zu einer Reduktion der IP3-abhängigen Ca2+ -Freisetzung. Mithilfe von anti-Cavβ3 Antikörpern wurde das Cavβ3 Protein präzipitiert und unter den Proteinen, die mit dem präzipitierte Cavβ3 assoziiert sind, befand sich der IP3 Rezeptor. Die Koimmunpräzipitation funktioniert auch umgekehrt. Cavβ Proteine besitzen zwei konservierte Regionen, C1 und C2, die essentiell zur Regulation der Cav Kanäle sind und Homologien zur Src-Homologiedomäne 3 (SH3, C1) sowie Guanylatkinase (GK, C2) aufweisen. Experimente mit SH3- und GK-defizienten sowie mit Plasmamembran-assoziierten β3 Proteinen, die jeweils nach Mutation der cDNA erhalten wurden, zeigen, dass die SH3 Domäne und die zytosolische Lokalisation von β3 notwendig für die Interaktion von Cavβ3 und IP3 Rezeptoren sowie die β3- abhängige Reduktion der Agonisten-induzierten Ca2+ -Freisetzung sind. Mithilfe von Glutathion S-Transferase "Pull Down" Experimenten wurden zwei neue Bindestellen für Cavβ3 im Bereich der Aminosäurereste 346-917 und 1387-2249 des IP3R3 lokalisiert. Die Migration der Fibroblasten, die aus Cavβ3-defizienten Tieren präpariert werden, war signifikant verändert gegenüber Fibroblasten von Wildtyp-Tieren. Diese in vitro Experimente haben wir versucht in ein in vivo Experiment zu übertragen und haben die Wundheilung von Wildtyp Mäusen und β3-defizienten Mäusen vergleichend untersucht. Die Wundheilung der Haut verlief signifikant schneller bei β3-defizienten Mäusen im Vergleich zu Wildtyp Mäusen. Zusammenfassend haben wir eine bisher unbekannte Cav-unabhängige Funktion des Cavβ3 Proteins entdeckt: In Gegenwart Cavβ3 sind Zellen weniger sensitiv gegenüber niedrigen IP3 Konzentrationen, wahrscheinlich indem Cavβ3 über seine SH3-Domaine mit der internen Bindedomäne des IP3-Rezeptors interagiert. Dies hat eine signifikanten Einfluss auf die Migration von Fibroblasten in vitro und die Wundheilung der Haut in vivo