In vitro Effektivität der Photodynamischen Therapie gegenüber multiresistenten Mikroorganismen

Abstract

Der vermehrte Einsatz von Antibiotika und die damit verbundene Zunahme an Resistenzen macht eine Erweiterung der Therapiemöglichkeiten, insbesondere zur Behandlung durch multiresistente Mikroorganismen hervorgerufener Infektionen, notwendig. Eine vielversprechende Maßnahme ist die Photodynamische Therapie (PDT), die im klinischen Alltag, zum Beispiel in der Dermatologie, schon ihre Anwendung findet. Diese Form der Therapie könnte es möglich machen, auch gegen verschiedene Antiinfektiva resistente Bakterien und Pilze zu eradizieren. Diese Arbeit soll Grundlagen zur Anwendung der PDT bei infektiösen Keratitiden schaffen, deren Ursprung sich in der Besiedelung der Hornhaut mit pathogenen Keimen äußert. Von klinischer Problematik sind hier vor allem multiresistente Varianten der Bakterienarten Pseudomonas aeruginosa und Staphylococcus aureus sowie der Hefe Candida albicans, die vielfach mit den im Klinikalltag verfügbaren Antiinfektiva nicht mehr therapierbar sind. Die PDT benötigt einen Photosensibilisator (PS), der mittels Lichtenergie angeregt wird, diese Energie auf Sauerstoff zu übertragen vermag und somit reaktive Sauerstoffspezies generiert. Diese können als molekulare toxische Substanzen den Zelltod hervorrufen. Als PS wurde im Rahmen dieser Arbeit das Chlorophyll-Derivat Chlorin e6 (Ce6) verwendet, welches durch Rotlicht aktiviert werden kann. Als Lichtquelle dienten LEDs (670 nm) mit einer Energiedosis (D) zwischen 1,87 J/cm2 für eine und 37,2 J/cm2 für zehn Minuten Bestrahlungsdauer (t) (Formel: D = P x t, P = Leistungsdichte der Dioden). Für die Testreihen wurden die Bestrahlungszeiten mit einer, fünf und zehn Minuten gewählt, die Inkubationszeiten mit fünf, 15 und 30 Minuten. Für die Aufgabenstellung, nämlich die Bestimmung der minimalen bakteriziden Konzentration (MBK), das heißt der Ce6/Lichtkombination, die eine Reduktion der bakteriellen Keimlast um mindestens 3 log10-Stufen (≥ 99,9 %) bewirkt, wurden neben Gramnegativen und -positiven Bakterien auch Hefen herangezogen. Die Effektivität des PS wurde über mehrere Konzentrationen (1 - 512 μmol) getestet. Im Einzelnen wurden von P. aeruginosa, S. aureus und C. albicans je 20 klinische Isolate untersucht. Orientierend kann gesagt werden, dass die hier getesteten Gram-negativen Bakterien eher unempfindlich gegenüber dieser Therapieform waren, da bei den meisten P. aeruginosa Isolaten mit keiner der hier verwendeten PS/Lichtkombinationen eine Reduktion der Keimlast um den Faktor ≥ 3 log10 erreicht werden konnte. Im Gegensatz dazu wiesen einzelne Stämme der getesteten Hefen und alle hier getesteten S. aureus Isolate schon bei Konzentrationen unter 100 μM des PS Abtötungsraten von ≥ 99,9 % auf. Die effektivste hier getestete Inkubationszeit lag bei allen getesteten Isolaten bei 30 Minuten, die beste Bestrahlungsdauer lag bei 10 Minuten. Bei vergleichenden Untersuchungen mit bakteriellen Pigmentmutanten konnte beobachtet werden, dass nicht pigmentierte Bakterien, sowohl Gram-negative, als auch Gram-positive, wesentlich empfindlicher gegenüber der PDT sind. Auffallend ist, dass die PS-Konzentrationen, die nach 30-minütiger Inkubation in bzw. an den Mikroorganismen gemessen werden konnten, nicht linear zur Abtötungsrate sind. Vielmehr konnte gezeigt werden, dass sowohl die hier getesteten Hefen als auch die getesteten Gram-negativen P. aeruginosa Isolate bei hohen Ce6 Konzentrationen erhöhte Überlebensraten aufwiesen, ein Phänomen, das in der Literatur als „Eagle Effect“ bekannt ist. Dieses Phänomen konnte bei S. aureus nicht beobachtet werden. Die im Rahmen dieser Arbeit erhobenen in vitro Befunde unterstreichen das Potential der PDT mittels Ce6 und Rotlicht als alternative Therapieform zur Behandlung von multiresistenten S. aureus Isolaten hervorgerufenen Keratitiden fungieren zu können. Sie weisen aber zum anderen auch darauf hin, dass ein Einsatz dieser PS/Lichtkombination zur Behandlung von P. aeruginosa und C. albicans induzierter Hornhautinfektionen, je nach Stammhintergrund, nicht wirksam sein könnte und das eine Überdosierung des PS vermieden werden sollte.

The frequent usage of antibiotics and the associated increase in multidrug resistant (MDR) microorganisms requires an expansion of our treatment options. One promising novel therapy option against MDR microorganisms is photodynamic therapy (PDT) that is already in clinical use as treatment of actinic keratosis in dermatology. This work aimed at providing a basis for the application of PDT as therapy option against infectious keratitis which is frequently caused by MDR bacterial species such as Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus, and the yeast Candida albicans. PDT requires a photosensitizer (PS), which is excited by light of a certain wavelength to generate reactive oxygen species (ROS) that cause cell death. Here, the efficiency of the photosensitizer chlorin e6 (Ce6) was tested in combination with red light (= 670 nm). A series of tests was performed with irradiation times of one, five and ten minutes, respectively, and incubation times ranging from five to 30 minutes, yielding in absorbed energy doses between 1.86 J/cm2 and 18.6 J/cm2. A total of 20 clinical P. aeruginosa, S. aureus and C. albicans isolates were used to determine the minimal bactericidal concentration (MBC) of this procedure (i.e. the minimal Ce6/red light combination resulting in a 3 log10 reduction in viable cells), and individual microorganisms were tested with several concentrations of the PS ranging from 1 - 512 μM. These tests identified that P. aeruginosa isolates are rather insensitive to this type of therapy, whereas most of the yeast isolates and all S. aureus strains were readily killed by relatively low concentrations of the photosensitizer (≥ 100 μM). A combination of 30 min co-incubation of the photosensitizer with the microorganisms and 10 min of light irradiation proofed to be the most effective protocol in killing the bacteria/yeast cells, while lower irradiation and incubation times had a negative impact on the MBCs. A comparison of bacterial pigment mutants and their corresponding parental strains revealed furthermore that non or low pigmented bacteria were more sensitive to photodynamic inactivation, and this was the case for both Gram-negative and Gram-positive bacteria. For both P. aeruginosa and C. albicans, decreased killing efficiencies were noticed with the highest Ce6 concentrations (512 μM), if compared to the killing rates seen with lower Ce6 doses. Notably, this phenomenon, known in literature as „Eagle Effect“, was not observed for S. aureus. Taken together, these data suggest that PDT with Ce6 and red light might be a promising new option for the treatment of corneal infections caused by MDR S. aureus. However, they also indicate that this therapy option might fail to cure infectious keratitis induced by P. aeruginosa and C. albicans, depending on the genetical background of the isolates, and that particular care should be taken to avoid an overdosing of the PS when treating the latter types of organisms with this type of therapy.