Validierung und Targetidentifizierung von differenziell exprimierten microRNAs in Fernmetastasen des klarzelligen Nierenzellkarzinoms

Abstract

Im klarzelligen Nierenzellkarzinom führt eine Metastasierung zu einer deutlichen Verschlechterung der Prognose. Es ist von zentraler Bedeutung, den Prozess der Metastasierung auf molekularbiologischer Ebene besser zu verstehen, um neue, spezifischere Therapiemöglichkeiten entwickeln zu können. MicroRNAs sind einzelsträngige RNA-Moleküle, die eine wichtige regulative Rolle in der Expression von Genen einnehmen. In mehreren Studien konnten im klarzelligen Nierenzellkarzinom bereits Expressionsunterschiede zwischen Tumor- und Normalgewebe sowie zwischen metastasierten und nicht-metastasierten Primärtumoren nachgewiesen werden. Bisher ist jedoch wenig bekannt über die Expression in Metastasen des klarzelligen Nierenzellkarzinoms. Mittels Microarray-Analysen konnten Voruntersuchungen signifikante Unterschiede in der Expression diverser microRNAs in Primärtumoren und Metastasen in Lunge, Knochen und Gehirn aufzeigen. Unter anderem waren hier miR-30c-2-3p und miR-29c-5p signifikant dereguliert. Weiterhin wurden einzelne microRNAs detektiert, die spezifisch an einzelnen Metastasenorten einen Expressionsunterschied aufwiesen. So war die Expression von miR-375-3p speziell in Lungenmetastasen signifikant verändert. Die Ergebnisse der Expressionsunterschiede in der Microarray-Analyse von miR-30c-2-3p, miR-29c-5p und miR-375-3p sollen in dieser Arbeit mittels quantitativer real-time Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) validiert werden. Basierend auf den qRT-PCR-Ergebnissen wird der funktionelle Einfluss von miR-30c-2-3p mittels Identifizierung ihrer potenziellen Protein-targets untersucht. Um die relative Genexpression von miR-30c-2-3p, miR-29c-5p und miR-375-3p durch eine qRT-PCR zu detektieren, wurde aus formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE)-Proben total-RNA von nicht-metastasierten (n=15) und metastasieren Primärtumoren (n=10) sowie Fernmetastasen aus Lunge (n=8), Knochen (n=6) und Gehirn (n=7) isoliert. Die Ergebnisse der Vorarbeiten für miR-30c-2-3p und miR-29c-5p im Vergleich nicht-metastasierter und metastasierter Primärtumoren konnten teilweise bestätigt werden. So waren miR-30c-2-3p und miR-29c-5p in metastasierten Primärtumoren weniger exprimiert als in nicht-metastasierten Primärtumoren, allerdings war der Unterschied nicht signifikant (miR-30c-2-3p: 1,7-fach; miR-29c-5p: 1,5-fach). Die Ergebnisse hinsichtlich der Expression in nicht-metastasierten Primärtumoren und Metastasen konnte vollständig bestätigt werden. Beide microRNAs waren signifikant herabreguliert in Metastasen der Lunge (miR-30c-2-3p: 4,3-fach, p<0,001; miR-29c-5p: 1,8-fach, p=0,014), Knochen (miR-30c-2-3p: 3-fach, p=0,006; miR-29c-5p: 2,8-fach, p=0,001) und des Gehirns (miR-30c-2-3p: 15,6-fach, p<0,001; miR-29c-5p: 4,3-fach, p<0,001). Nur teilweise bestätigt werden konnte die generell verminderte microRNA-Expression in den einzelnen Metastasenorten im Vergleich zu metastasierten Primärtumoren. Für miR-30c-2-3p war dies in Lungenmetastasen (2,5-fach, p=0,016) und Hirnmetastasen (9-fach, p=0,002) möglich. Die Expression in Knochenmetastasen war tendenziell vermindert. MiR-29c-5p war in Hirnmetastasen 2,8-fach (p=0,006) weniger exprimiert. Für Lungen- und Knochenmetastasen war eine Tendenz festzustellen. In Zusammenschau der Ergebnisse fällt also auf, dass miR-30c-2-3p und miR-29c-5p zumindest tendenziell in metastasierten Primärtumoren niedriger exprimiert sind als in nicht-metastasierten Primärtumoren. Signifikant oder zumindest tendenziell sind sie in den Hauptmetastasierungsorten noch weiter herabreguliert. Die verminderte Expression der untersuchten microRNAs weist auf eine Beteiligung im Prozess der Metastasierung hin. Weiterhin sollte überprüft werden, ob eine ortsspezifische Expression von miR-375-3p in Lungenmetastasen vorliegt. Die Ergebnisse der Vorarbeiten konnten vollständig bestätigt werden. miR-375-3p war in Lungenmetastasen sowohl im Vergleich zu nicht-metastasierten (19,6-fach, p<0,001) und metastasierten Primärtumoren (25,3-fach, p=0,001) als auch zu Hirnmetastasen (29,4-fach, p=0,003) und Knochenmetastasen (58,8-fach, p=0,002) überexprimiert. Diese Ergebnisse deuten auf differenzielle Prozesse in den verschiedenen Metastasenorten hin. Basierend auf den Ergebnissen des ersten Teils der Arbeit wurde miR-30c-2-3p ausgewählt, um potenzielle Protein-targets zu identifizieren. Hierzu wurde miR-30c-2-3p mittels einer transienten Transfektion in der Zelllinie 786-O eines klarzelligen Nierenzellkarzinoms überexprimiert. Die target-Kandidaten wurden anschließend mittels zweidimensionaler differentieller Gelelektrophorese (2D-DIGE) und folgender Liquid-Chromatographie-Massenspektrometrie/ Massenspektrometrie (LC-MS/MS) ermittelt. Außerdem wurde darüber hinaus ein Abgleich der komplementären Nukleotidsequenzen von miR-30c-2-3p und den messengerRNAs der potenziellen targets durch das Programm miRWalk durchgeführt. Nach Analyse der Nukleotidsequenzen zeichnete sich einzig Cofilin als potenzielles target ab. Die messengerRNAs der übrigen Proteine waren nicht komplementär zu miR-30c-2-3p und können daher als direkte targets ausgeschlossen werden. Cofilin besitzt eine regulative Funktion auf die Dynamik des Zytoskeletts, indem es im Auf- und Abbau von Aktin beteiligt ist und somit das Migrationsverhalten von Zellen beeinflusst. Tumorzellen besitzen eine erhöhte Fähigkeit zur Migration, sodass die Ergebnisse darauf hindeuten, dass miR-30c-2-3p auf den Metastasierungsprozess des klarzelligen Nierenzellkarzinoms einen funktionellen Einfluss ausübt. Abschließend lässt sich hervorheben, dass die Ergebnisse der vorliegenden Promotionsarbeit durch die Verifizierung der microRNA-Expression und Identifizierung potenzieller targets von miR-30c-2-3p einen Beitrag zum besseren Verständnis des Metastasierungsprozesses im klarzelligen Nierenzellkarzinom leisten. Basierend auf diesen Ergebnissen müssen weitere Studien klären, ob sich die erprobten microRNAs für neue Therapieansätze oder Prognosemarker für Metastasen im klarzelligen Nierenzellkarzinom bewähren.

The prognosis of clear cell renal cell carcinoma still depends significantly on the status of metastases. It is therefore essential for improving the therapeutic options to achieve a better understanding of the metastastic mechanisms on molecular base. MicroRNAs are single-stranded RNA-molecules that play a central role in regulating the expression of genes. For clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) several studies could already demonstrate different microRNA-expression in primary tumors and normal kidney tissue as well as in non-metastatic and metastatic primary tumors. Nonetheless there exist few studies that examine the microRNA-expression in metastatic tissue. Previous microarray-analyses showed significant differences in the expression of several microRNAs comparing primary tumors and metastases of lung, bones and the brain in ccRCC. Among others miR-30c-2-3p and miR-29c-5p were significantly deregulated. Furthermore, some microRNAs showed specific alterations in specific metastasis locations. MiR-375-3p was characteristically alternated in metastasis of the lung. The present study intends to validate these results by quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction (qRT-PCR). Based on the results of the qRT-PCR the functional effect of miR-30c-2-3p has to be further investigated by identifying potential target-candidates on protein level. To detect the relative gene expression of miR-30c-2-3p, miR-29c-5p and miR-375-3p via qRT-PCR total-RNA was extracted from formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) samples including 15 non-metastatic, and 10 metastatic, primary tumors as well as distant metastases of the lung (n=8), bones (n=6) and brain (n=7). The results of the microarray-analyses for miR-30c-2-3p and miR-29c-5p in non-metastatic and metastatic primary tumors have been partly confirmed. Thus miR-30c-2-3p and miR-29c-5p were less expressed in metastatic primary tumors than in non-metastastic primary tumors. The difference here was not significant (miR-30c-2-3p: 1,7-fold; miR-29c-5p: 1,5-fold). With regard to their expression in non-metastastic primary tumors and metastases the results could completely be affirmed. The expression of both microRNAs was significantly decreased in metastases to the lung (miR-30c-2-3p: 4,3-fold, p<0,001; miR-29c-5p: 1,8-fold, p=0,014), bones (miR-30c-2-3p: 3-fold, p=0,006; miR-29c-5p: 2,8-fold, p=0,001) and brain (miR-30c-2-3p: 15,6-fold, p<0,001; miR-29c-5p: 4,3-fold, p<0,001). Partially confirmed was the overall decreased expression in the single metastatic sites compared to metastatic primary tumors. MiR-30c-2-3p was significantly decreased in metastases to the lung (2,5-fold, p=0,016) and brain (9-fach, p=0,002). In bone metastases miR-30c-2-3p showed a trend to lower expression. MiR-29c-5p was significantly decreased in brain metastases (2,8-fold, p<0,006). MiR-29c-5p was not significantly down-regulated in metastases to the lung and bones. Nonetheless, a trend was shown. In conclusion, miR-30c-2-3p and miR-29c-5p were at least partially down-regulated in metastatic primary tumors compared to non-metastatic primary tumors. Both were even more down-regulated in the main metastatic sites. This could be demonstrated either significantly or as a trend. Hence, the decreased expression point to a participation of the examined microRNAs in the metastasis process. Another aim of the present work was to validate the expression of miR-375-3p that was specifically up-regulated in lung metastases. The results of the previous work could completely be affirmed. Not only was miR-375-3p significantly up-regulated in lung metastases compared to non-metastastic (19,6-fold, p<0,001) and metastatic (25,3-fold, p=0,001) primary tumors but also to bone (58,8-fold, p=0,002) and brain (29,4-fold, p=0,003) metastases. These results indicate specific molecular processes depending on the metastatic site. Based on the findings of the first part miR-30c-2-3p was elected to investigate its potential target candidates. Thus, miR-30c-2-3p was up-regulated in the cell line 786-O of a clear cell renal cell carcinoma by transient transfection. The target-candidates were thereafter detected by two dimensional gel electrophoresis and liquid-chromotography mass spectrometry/mass-spectrometry. Moreover, a comparison of the nucleotide sequences of miR-30c-2-3p and complementary messengerRNA of the detected proteins was made by the software miRWalk. After matching the nucleotide sequences cofilin remained as the only potential target. All other detected proteins did not show a sufficient complementary between the nucleotide sequence of their messengerRNAs and miR-30c-2-3p and hence can be excluded. Cofilin is an actor in the dynamics of the cytoskeleton regulating the assembling and degrading of actin. Thus, it determines the ability of cells to migrate. Tumor cells tend to possess an increased activity of migration. Therefore, the results of the present work point to a functional role of miR-30c-2-3p in the metastasis process. In conclusion, the results of this study lead to a better understanding of the metastasis process in ccRCC by verifying microRNA expression and identifying potential targets of miR-30c-2-3p. Based on these results further research needs to be conducted to clarify the potential of the investigated microRNAs as therapeutic options or as prognostic markers.