Charakterisierung der molekularen Regulation von Physiologie und Pathologie des Herzens anhand spezifischer in vivo-Modelle

Abstract

Im Menschen ist das Herz das zentrale Organ des kardiovaskulären Systems, seine Pumpleistung erhält die Körperhomöostase aufrecht. Die Funktion des Herzens wird hierfür durch eine große Zahl von Hormonen und deren nachgeschalteten intrazellulären Signalverarbeitungsmechanismen moduliert und reguliert. In dieser Arbeit wurden mithilfe von spezifischen Tiermodellen drei dieser Signalkassetten genauer untersucht: Die atypischen Proteinkinasen C, Gq/11 Proteine sowie deren Hormone und die ß2-Untereinheit des spannungsgesteuerten Kalziumkanals im Herzen. Atypische Proteinkinasen C stellen eine Unterfamilie der Proteinkinasen C dar, und besitzen eine große Bedeutung bei einer Vielzahl von intrazellulären Regulationsprozessen, wie Kontraktion oder Regulation des Zytoskeletts. Ihre Rolle im Herzen ist weitgehend unbekannt, was sicherlich auch darin begründet liegt, dass keine spezifischen pharmakologischen Werkzeuge zu ihrer Aktivitätsmodulation bekannt sind. In dieser Arbeit wird ein neuartiger Ansatz zur Untersuchung der Proteinkinase C iota gewählt. Durch virusvermittelte herzspezifische in vivo Expression von aktivitätsinhibierten (DN) bzw. konstitutiv aktiven (CA) Isoformen der PKCi konnten die entsprechenden Aktivitätsmodulationen dieses Enzyms in den Herzmuskelzellen erreicht werden. Die Resultate einer solchen Intervention wurden hinsichtlich ihrer in vivo Effekte, aber auch bezüglich möglicher Veränderungen der Morphologie des einzelnen Kardiomyozyten, untersucht. Die Reduktion der intrazellulären PKCi-Aktivität durch die DN-PKCi führte in der Echokardiographie in vivo zu einer milden kardialen Hypertrophie, die Überexpression der CA wie auch der unveränderten Wildtyp-Form induzierten allerdings keine Veränderungen der Herzfunktion. Diese Befunde am lebenden Tiermodell konnte durch Untersuchungen der Morphologie der einzelnen Herzmuskelzellen gestüzt werden. Charakteristische Membraneinstülpungen, die TTubuli, waren nach Reduktion der intrazellulären PKCi- Aktivität ebenfalls deutlich reduziert. Allerdings kehrten sich die Effekte um, wenn dieselben Isoformen in Herzen exprimiert wurden, in denen durch TAC eine Hypertrophie ausgelöst wurde. Hier führte die Heraufregulation der intrazellulären PKCi Aktivität zu einer signifikanten Verminderung der Hypertrophie. Aus diesen Befunden kann geschlussfolgert werden, dass die PKCi Aktivität im Herzen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von Herzkrankheiten, wie der Herzmuskelschwäche, besitzt und unter Umständen ein neues pharmakologisches Target für deren Therapie darstellen könnte. Im Herzen besitzen die GaqG11 Proteine eine wichtige Relaisfunktion bei der Transduktion von hormoneller Aktivierung in zelluläre Antworten, wie beispielsweise bei der Kontraktionsmodulation und dem zellulären Wachstum. Im zweiten Teil dieser Arbeit war daher die Rolle von GaqG11-Proteinen bei Hypertrophieentwicklung durch Nachlasterhöhung und bei Hyperaldosteronismus im Fokus der Untersuchungen. Insbesondere wurde der Zusammenhang dieser Untereinheiten mit dem profibrotischen Effekt von Aldosteron hinterfragt. Dazu wurde den Tieren über sechs Wochen Aldosteron mit einer subkutanen Minipumpe appliziert, die Tiere echokardiographisch untersucht und histologische Schnitte der Herzen auf den Kollagengehalt geprüft. Für die Kollagenbestimmung wurden zwei verschiedene Verfahren gewählt: Die Lichtpolarisation und die spezifische Fluoreszenz der Färbung mit Siriusrot. Es zeigte sich eine Überlegenheit der Fluoreszenzmikroskopie. In der Auswertung ergab sich, dass in der Maus, welcher durch konditionelles induziertes Knockout Gaq- und G11-Untereinheiten fehlten, weniger kardiales Kollagen durch Aldosteron gebildet wurde, als in den Vergleichstieren mit physiologischer Ausprägung der Untereinheiten. Im dritten Teil meiner Arbeit erfolgten Untersuchungen zur Funktion der ß2-Untereinheit des spannungsgesteuerten Kalziumkanals im Herzen, der bei der elektromechanischen Kopplung (Übersetzung der elektrischen Aktivität in mechanische Arbeit) eine zentrale Rolle besitzt. Hierzu sind neuartige Tiermodelle verwendet worden, in denen diese Untereinheit genetisch ausgeschaltet wurde (ß2KO-Maus). Aufbauend auf diese Tiermodelle erfolgte eine Charakterisierung der Rolle von neu identifizierten embryonalen und adulten Spleißvarianten der ß2- Untereinheit in vivo, auf dem Hintergrund der ß2KO-Maus. Dazu wurden die entsprechenden Tiere einer echokardiographischen Untersuchung unterzogen. Der herzspezifische, postnatal induzierte Verlust der Genexpression bewirkte eine Verminderung des ventrikulären Volumens, bei deutlichem Gewichtsverlust, der eine Belastung nahe legt. Dieser Phänotyp war jeweils durch Expression einer der beiden Spleißvarianten des Gens zu retten.

Characterization of the molecular regulation of cardiac physiology and pathophysiology by using specific in vivo mouse models The human heart is the central organ of the circulation system, and its pumping capacity maintains the physiological homeostasis in the body. The function of the heart is regulated by a large number of hormones, and their subsequent intracellular signal transduction cascades. In this work, three aspects of these cascades were analyzed by using specific animal models: The atypical protein kinase Ci, the GaqG11-proteins and their hormonal interactions, and the ß2-subunit of the voltage-sensitive calcium channel in the heart. The atypical protein kinases C are a subfamily of the protein kinases C, playing an important role in a plenty of intracellular regulatory processes, as cellular contraction or regulation of the cytoskeleton. Their exact role in cardiac myocytes is mostly unknown yet, due to the fact that there are no specific agents available to modulate the activity of these enzymes specifically. Therefore, in this project, a new approach was used. The activity of the enzyme was modulated by viral transduction and cardiac-specific expression of activity-inhibited or constitutively active isoforms of PKCi. The effects of this intervention were both examined in vivo, an by studying the morphology of the singular cardiomyocytes. The reduction of the intracellular acivity of PKCi caused a mild cardiac hypertrophy, whereas there was no change in cardiac function by increased activity, compared to the wildtype. These in vivo results were supplemented by the morphological characteristics of the isolated ventricular myocytes. Typical membrane invaginations, the T-tubules, were reduced and disorganized by downregulating PKCi activity. After aortic banding in these mice, the in vivo effects turned to the opposite. By increasing PKCi activity, the induced hypertrophy was markedly reduced, compared with the downregulation of PKCi, and wildtype. Regarding these results, it is obvious that PKCi may play an important role in the development of cardiac pathologies, and may therefor be a new target for cardiac specific therapies. Likewise in the heart, GaqG11 proteins play an important role in the transduction of hormonal signals into cellular reactions, as in the modulation of contractoin, or in cellular growth. Therefore, in the second project, the functions of the GaqG11 proteins in hypertrophy and hyperaldosteronism were in the focus of research. In particular, the role of these proteins in the profibrotic stimulus by aldosterone was of special interest. To figure out this correlation, mice of a GaqG11-KO line were treated by chronic subcutaneous infusion of aldosterone over 6 weeks, subsequently examined in vivo by cardiac ultrasound. Finally, histological preparations of their hearts were specifically stained to detect collagen content, and then imaged by two different methods. At first, polarization microscopy was done, a established way to detect intercellular collagen; additionally, the specific fluorescence of the stained tissue was detected by fluorescence microscopy. In this study, fluorescence microscopy was superior. Regarding the profibrotic effect, mice with GaqG11-KO showed less cardiac collagen content increase than the wildtype mice. In the third project, the ß2-subunit of the voltage-sensitive calcium channel was examined. This channels plays an important role in the electro-mechanical coupling, which is necessary to translate the electrical stimulus into the mechanical work of cellular contraction. For this study, a new mouse model of induced cardiac knockout of the ß2-subunit was used. Additionally to these animals with ß2-KO, the importance of both a juvenile and an adult splice variant of the ß2-subunit was tested. To find out the physiological effects, all mouse models underwent echocardiographic examination. The induced ß2-KO led to a diminuished ventricular volume, and to a loss of body weigth that indicated physiological stress. Expression of each of the both splice variants was able to rescue this phenotype.