Herstellung von Vektoren zu Ko-Expression fluoreszierender Proteine und miRNAs in eukaryotischen Zellen

Abstract

MicroRNAs (miRNAs) sind kleine, nicht kodierende RNAs, welche die Proteintranslation posttranskriptionell regulieren. Ausgangspunkt der Arbeit war der Befund, dass die miR-142 in ca. 20% aller diffus großzelligen B-Zell Lymphome (DLBCL) durch Mutationen verändert vorliegt (Kwanhian et al., 2012). Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden fluoreszierende Proteine und miRNAs in eukaryotischen Zellen ko-exprimiert. Bei den miRNAs handelte es sich um die miR-142-wt, eine miR-142-3p und eine miR-142-5p Mutante sowie die miR-34a. Der Vektor pcDNA3.1/Hygro(-) wurde zur Klonierung der miR-142 und deren Mutanten verwendet. In einem ersten Schritt wurde eGFP in die MCS zwischen die Schnittstellen für XbaI und HindIII kloniert, sodass das Produkte pcDNA3.1/Hygro(-)GFP entstand. Dieser Klonierungsschritt wurde auch für mCherry durchgeführt, sodass auch der Vektor pcDNA3.1/Hygro(-)mCherry durch Klonierung gebildet wurde. Unter dem Fluoreszenzmikroskop ließ sich in transfizierten Zellen eine deutliche Überexpression der Fluoreszenzproteine nachweisen. Im Anschluss erfolgte die Sequenzierung. Die folgenden Experimente wurden nur für den Vektor pcDNA3.1/Hygro(-)GFP durchgeführt. In weiteren Schritten wurde die precursor-Sequenz der miR-142-wt, der miR-142-mut2 (3p-Mutante) und miR-142-mut3 (5p-Mutante) durch PCR amplifiziert und zwischen die Schnittstellen für BamHI und XhoI an das 3´ Ende der eGFP-Sequenz in den Vektor inseriert. Kontrollen mittels Fluoreszenzmikroskopie bestätigten, dass eGFP weiterhin überexprimiert wurde, was ebenfalls durch Western Blot bestätigt wurde. Im Northern Blot war sowohl die reife miR-142 als auch die pre-miR-142 sichtbar, sowohl der Mutante 2, 3 als auch der miR-142-wt. Zusätzlich wurde die miR-34a und miR-200c in den Vektor pSG5-GFP kloniert. Hierbei wurden die gleichen Methoden angewendet wie oben beschrieben. Zuletzt wurde eine deutliche Überexpression der miR-34a im Northern Blot bestätigt. Bei den Experimenten wurde mittels Western Blot die Expression von eGFP, mittels Northern Blot die Anwesenheit der miRNA und durch Sequenzierung die korrekte DNA-Sequenz ermittelt.

MicroRNAs (miRNAs) are short, non-coding RNAs that post-transcriptionally regulate gene expression. The basis for this work was the finding that miR-142 is mutated in about 20% of diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) (Kwanhian et al., 2012). In this thesis, vectors were generated to achieve the co-expression of fluorescent proteins and miRNAs in eukaryotic cells. The miRNAs of interest were miR-142-wt, one miR-142-3p mutant and one miR-142-5p mutant as well as miR-34a. For the miR-142 experiments, the vector pcDNA3.1/Hygro(-) was used. First, the eGFP gene was cloned into the MCS of pcDNA3.1/Hygro(-) between the restriction sites XbaI and HindIII. The cloning resulted in the product pcDNA3.1/Hygro(-)GFP. Analogously mCherry was cloned building the vector pcDNA3.1/Hygro(-)mCherry. Using fluorescence microscopy, the expression of eGFP and mCherry in eukaryotic cells was shown. The following experiments were only done with the vector pcDNA3.1/Hygro(-)GFP. The precursor for miR-142-wt, miR-142-mut2 (3p-mutant) and miR-142-mut3 (5p-mutant) were amplified by PCR and inserted directly behind the 3´ end of the coding sequence of the gene eGFP between the BamHI and XhoI restriction sites. The expression of eGFP was verified by fluorescence microscopy and by Western blot. Expression of the miR-142-wt, miR-142-mut2, miR-142-mut3 as well as the corresponding precursor RNAs was shown by Northern blotting.

Another series of experiments were done cloning the miR-34a and the miR-200c into the vector pSG5-GFP. The same methods were applied as described above. The expression of miR-34a was demonstrated by Northern blot. In addition, western blots were carried out to show the expression of the eGFP-Protein. The correct sequence of the inserted miRNA was determined by sequencing.