Validierung und Targetidentifizierung der metastasierungsassoziierten microRNA-30a-3p und microRNA-10b-5p zur Prognosebewertung beim klarzelligen Nierenzellkarzinom

Abstract

Da das Nierenzellkarzinom (NZK) der Tumor mit der höchsten Letalität des Urogenitalsystems ist, ist es erstrebenswert, bereits zu einem frühen Zeitpunkt das Metastasierungsverhalten des Tumors und die Prognose des Patienten möglichst präzise individuell einschätzen zu können. Dabei können miRNAs als prognostische Marker eingesetzt werden. In dieser Arbeit wurde die Expression der miRNAs miR-30a-3p und miR- 10b-5p in Tumorgewebeproben von 50 metastasierten und 50 nicht metastasierten klarzelligen NZK sowie 10 Normalgewebeproben untersucht. Zudem wurde die Auswirkung einer Überexpression der miR-30a-3p auf die Expression ausgewählter Targetproteine, die mit der Zellintegrität bzw. Zellmigration assoziiert sind, analysiert. Die Isolation der Gesamt-RNA erfolgte mittels eines präzipitationsbasierten Kits aus Formalin-fixierten, Paraffin-eingebetteten (FFPE) Gewebeproben. Die Expression von miR- 30a-3p und miR-10b-5p wurde durch reverse Transkription (RT) mit spezifischen Primern und einer sich anschließenden Taqman-Sonden basierten Realtime-PCR analysiert. Unter Berücksichtigung des Follow-ups der Patienten wurde untersucht, ob die Expression der beiden miRNAs signifikant mit dem klinischen Verlauf (metastasenfreies Überleben, Gesamtüberleben) assoziiert ist. Im zweiten Teil der Arbeit wurde miR-30a-3p in der NZKZelllinie 786-O mittels transienter Transfektion überexprimiert sowie die Auswirkung dieser Überexpression auf die Expression des Targetproteins Cofilin mittels Westernblotanalyse untersucht. Mit Zunahme der Malignität des Gewebes zeigte sich eine signifikant abnehmende Expression der beiden miRNAs. Eine verminderte Expression der miR-30a-3p war mit einem signifikant verkürzten metastasierungsfreien Überleben assoziiert (p=0,02). Als prognostischer Marker zur Vorhersage der Metastasierung erreichte miR-30a-3p eine Sensitivität von 60% und eine Spezifität von 70%. Eine verminderte Expression der miR-10b- 5p ließ einen Trend bezüglich eines verkürzten metastasierungsfreien Überlebens erkennen (p=0,107). Im Bezug auf das Gesamtüberleben konnte keine statisitsch signifikante Korrelation zur Expression der miR-30a-3p nachgewiesen werden, die miR-10b-5p sagte tendenziell ein verkürzteres Gesamtüberleben bei erniedrigter Expression voraus (p=0,174). Im zweiten Teil der Arbeit konnte gezeigt werden, dass eine artifizielle Hochregulation von miR-30a-3p zu einer geringeren Expression des Targetproteins Cofilin führt, dies war jedoch nicht signifikant. MiR-30a-3p und miR-10b-5p konnten in dieser Arbeit als prognostische Marker für das Nierenzellkarzinom bestätigt werden. Um jedoch eine ausreichend hohe Sensitivität und Spezifität in der Vorhersage einer Metastasierung erreichen zu können und hieraus auch Konsequenzen im Sinne einer intensiveren Nachsorge oder adjuvanten Therapie abzuleiten, müssten vermutlich mehrere miRNAs kombiniert betrachtet werden. Da es mittlerweile mehr als 2000 identifizierte miRNAs gibt, die einen Einfluss auf Apoptose, Proliferation und Invasion von Zellen haben können, und die Metastasierung einen komplexen Prozess darstellt, liegt es nahe, dass nicht eine miRNA alleine für das gesamte Metastasierungsverhalten der Zellen und das Expressionsverhalten von Targetproteinen verantwortlich sein kann. Durch die Kombination verschiedener miRNAs soll in zukünftigen Arbeiten ein prognostischer Score entwickelt werden, der eine ausreichende Vorhersagekraft besitzt, um prospektiv in klinischen Studien überprüft zu werden.

Titel: Validation and target identification of miR-30a-3p and miR-10b-5p for prediction of metastatic risk in clear cell renal cell cancer Because of the upmost lethality of the renal cell cancer in the urological system it is important to define the risk of metastasis and the prediction at an early date. By this assignment the prognostic value of the miR-30a-3p and miR-10b-5p was validated in an independent pool of patients (50 metastazised, 50 non metastazised ccRCC and 10 normal kidney tissue). Potential target-proteins for the miR-30a-3p were approved experimentally. The total RNA was isolated from FFPE-tissue by using 50 non-metastastic and 50 metastastic RCC. The expression of miR-30a-3p and miR-10b-5p was quantified using specific TaqMan primers with qRT-PCR. The assoziation between the expression of the two miRNAs and the clinical outcome of the patients (progressionfree-survival and overal survival) was investigated.The target validation was effected in vitro in the cell line 786-O using transient overexpression of miR-30a-3p.The effect of the target protein Cofilin was verified with western blot analysis. The increase of the malignancy is associated with the decreased expression of the two miRNAs. In metastatic RCC miR-30a-3p and miR-10b-5p are significantly deregulated (p<0,001). A lower expression of miR-30a-3p significantly correlates with an abbreviated progression-free survival (p=0,02;sensitivity 60%;specifcity 70%). A lower expression of miR- 10b-5p was associated with a abbreviated progression-free survival (p=0,107). In relation to the overall survival no statistically significant correlation to the expression of miR-30a-3p exist. A lower expression of miR-10b tends to an abbreviated overall survival (p=0,174). The artificial overexpression of miR-30a-3p in vitro tends to result in a reduced concentration of the target Cofilin. In conclusion miR-30a-3p and miR-10b-5p could serve as prognostic marker for the metastasis behavior in the clear cell renal cell carcinoma. The evaluation of an only one single miRNA seems not sufficient for a precise prognostic prediction because of more then 2000 identifed miRNAs with an influence on apoptosis, proliferation and invasion of cells and because of the high complexity of metastastic processes. To reach a sensitive and spezific prognosis with a use in the clinical aftercare and adjuvant therapy multiple miRNAscombinations need to be investigated. The next step should include the development of a prognostic score that have to be tested in clinical trial.