Expression des endogenen retroviralen Proteins Np9 in Tumorstammzellen der akuten myeloischen Leukämie (AML)

Abstract

„Nuclear protein of 9 kDa“ (Np9) ist ein Protein mit einem geschätzten Gewicht von neun Kilodalton, welches vor allem im Zellkern vorliegt. Das np9-Gen entstand während der Evolution von zwei Typen des humanen endogenen Retrovirus‘ HERV-K(HML-2) als virales „Accessory“-Gen (Zusatzgen). Typ 2 wurde durch Infektion der Keimbahn von Altwelt-Affen (Catarrhini) vor circa 30 Millionen Jahren Bestandteil des Genoms. Etwas später entwickelte sich durch den Verlust von 292 Basenpaaren und dem Zugewinn einer Spleißdonor-Stelle (SD2) Typ 1. Die SD2 verleiht dem Virus die Fähigkeit zur Translation des Np9-Proteins. Sie ist einzig bei Gorillas, Schimpansen und den Menschen (Homininae) vorhanden. Einige Arbeitsgruppen konnten zeigen, dass HERV-K(HML-2)-Transkripte einen Marker für embryonale und pluripotente Stammzellen darstellen. Insbesondere auch in Tumor-assoziierten (leukämischen) Stammzellen konnte np9-Transkript nachgewiesen werden. Während Transkripte relativ leicht nachweisbar sind, kann Np9-Protein bis zu diesem Zeitpunkt kaum und nur unter Vorbehalt gezeigt werden, so dass es bislang unklar war, ob Np9-Protein überhaupt in Zellen hergestellt wird und welche Funktion es hat. Um die Expression von Np9-Protein erstmals untersuchen zu können, reicherten wir zu-nächst Tumorstammzell-ähnliche Zellen in Kulturen der drei AML-Zelllinien HL-60, KG-1a und Kasumi 1 an. Die Elimination von Nicht-Stammzellen aus den Kulturen verifizier-ten wir durch das Auftreten der aktiven Form der primär apoptotischen Caspase 3. Stamm-zellen hingegen erwiesen sich als negativ für Caspase 3 jedoch positiv für den Stammzell-marker Survivin. Erstmalig gelang uns, ohne weitere Vorbehandlung, der Nachweis von endogenem Np9-Protein, vor allem in HL-60 Zellen. In vorherigen Studien war dies nur unter Einsatz eines Proteasomenblockers, wie Epoxomycin oder MG132 gelungen. Dies wies darauf hin, dass Np9 zwar produziert wird, aber instabil ist und über das 26S-Proteasom abgebaut wird. Außerdem wurde Np9 durch die Rapamycin-vermittelte Hem-mung des mTOR-Signalwegs induziert. Entsprechend der Erkenntnis, dass in einigen Stu-dien aktives Vitamin D (1,25 (OH)2D3), ähnlich wie Rapamycin, als Inhibitor des mTOR-Signalwegs wirken kann, konnten wir in HL-60 Zellen unter Vitamin D eine schwache In-duktion der Np9-Expression zeigen, nicht jedoch in die beiden anderen Zelllinien. Konzep-tionelle und technische Schwierigkeiten ergaben sich hingegen bei den Untersuchungen mit RNAi-Technologie, mit der wir den Effekt eines np9-Knockdowns auf Tumorstammzellen untersuchen wollten. Damals und auch heute noch existiert keine Möglichkeit für einen spezifischen Knockdown von np9, da Np9 aus einem polygenischen Transkript translatiert wird. Weiterhin bleibt unklar, ob nach Stammzellanreicherung alle Zellen einen im Verhält-nis geringen Gehalt an Np9 besitzen oder ob eine spezifische Subpopulation vergleichswei-se viel Np9 besitzt. Dennoch gelang hier erstmals der Nachweis des endogenen Np9-Proteins in Tumorstammzellen, vor allem aufgrund der extremen und technisch an-spruchsvollen Verbesserung des Proteinnachweises mittels des hier etablierten hochsen-siblen Westernblotting Nachweisverfahrens für Np9.

Nuclear protein of 9 kDa (Np9) is a protein with a predicted molecular weight of nine kDa which especially exists in the cell nucleus. The gene of np9 emerges from two types of human endogenous retrovirus HERV-K(HML-2) as a viral “accessory”-gene. Type 2 ini-tially integrated in genome due to infection of the primate germ line of Old World monkeys (Catarrhini) 30 million years ago. Some years later type 1 develops from type 2 through 1) lack of a 292 base pair sequence and 2) generation of a splice donor site (SD2). Due to SD2, which is specifically in gorillas, chimpanzees and humans (Homininae), the virus gets the possibility to translate Np9 protein. Some work groups showed that HERV-K(HML-2) transcripts are a marker for embryonic and induced pluripotent stem cells. Es-pecially in tumor-associated (leukemic) stem cells may be evidenced np9 transcript. Tran-scripts were really easy detectable, but not Np9 protein at this point except with reserva-tions. Therefore, it was not clear, if Np9 protein is produced in the cells and which func-tion it has at all. Primarily we enriched cancer stem cell-like cells from the AML cell lines HL-60, KG-1a and Kasumi-1 to analyze the expression of Np9 protein for the first time. To verify the elimination of not-stem cells we used cleaved caspase 3, which is the active and primary apoptotic form. Stem cells are negative for cleaved caspase 3, but positive for the stem cell marker Survivin. For the first time, we provided evidence of endogenous Np9 protein, especially in HL-60, without any pretreatment. Previous studies managed to do this only in use with proteasome inhibitors like Epoxomicin or MG132. Consequently, we gathered that Np9 is produced, but just as an unstable version, which is reduced through the 26S-proteasome. Moreover, Np9 induced the rapamycin-induced inhibition of the mTOR-pathway. Some studies showed that active vitamin d (1,25 (OH)2D3) affects the mTOR-pathway like Rapamycin. Based on this information, we proved a small induction of Np9 expression in vitamin d treated HL-60 cells, but not for the other two cell lines. However, we had conceptual and technical challenges with the RNAi-technology. We used this meth-od to show the effect of np9 knockdown in tumor stem cells. But at that time and for now, it does not exist any possibility for a specific knockdown just of np9, because of np9 translation from a polygenic transcript. Furthermore, it is still unclear, if all cells contain proportionally a really small content of Np9 or if there is a specific subpopulation, which includes comparatively lots of Np9, after stem cell enrichment. Nevertheless, we proved endogenous Np9 protein in tumor stem cells for the first time, but mainly due to extreme and technical ambitious improvement of protein detection with es-tablished highly sensitive Western blotting for Np9.