Apolipoprotein E-Defizienz führt zu verzögertem Kallusremodelling während der Frakturheilung in der Maus

Abstract

In aktuellen Studien konnte belegt werden, dass die beiden Volkskrankheiten Atherosklerose und Osteoporose bei Patienten häufig gleichzeitig vorliegen. Oxidierte Lipide scheinen nicht nur an der Pathogenese der Atherosklerose beteiligt zu sein, sondern begünstigen gleichermaßen die Entstehung der Osteoporose. Dies ist vermutlich auf eine Hemmung der Osteoblastendifferenzierung durch besagte oxidierte Lipide zurückzuführen. In atherosklerotischen Plaques werden allerdings auch Wachstumsfaktoren exprimiert, die für die Knochenmineralisierung und Angiogenese während der Frakturheilung bedeutsam sind. Bislang gibt es unseres Wissens nach keine Erkenntnisse darüber, inwieweit sich vorbestehende atherosklerotische Gefäßveränderungen auf die Knochenheilung auswirken. In der vorliegenden Arbeit sollten nun erstmals Erkenntnisse über den Einfluss atherosklerotischer Veränderungen des Gefäßsystems auf die Knochenheilung mithilfe einer tierexperimentellen Studie gewonnen werden. Aus den gewonnenen Ergebnissen könnten sich neue Therapieansätze der Frakturbehandlung bei Patienten mit atherosklerotischen Gefäßveränderungen ergeben. Wie aus vorausgegangen Tierstudien bekannt ist, führt eine Mutation im Apolipoprotein E- Gen über eine Hyperlipidämie zu ausgeprägten atherosklerotischen Gefäßveränderungen im Organismus. Als Versuchstiere wurden deshalb 43 ApoE-Knockout-Mäuse, die aus einem gentechnisch manipulierten Maus-Stamm gezüchtet wurden, herangezogen. Als Kontrolle dienten 44 Mäuse des zugehörigen Wildtyps C57BL/6. Nach einer geschlossenen Frakturierung des rechten Femurs mit anschließender Stabilisierung durch eine intramedulläre Zugschraube wurden die Versuchstiere nach zwei bzw. vier Wochen durch eine Überdosis Phenobarbital getötet. Im Anschluss daran erfolgten histomorphometrische, biomechanische sowie proteinbiochemische Untersuchungen am resezierten Femur. In der histomorphometrischen Auswertung wurden die Größe und die Gewebezusammensetzung des Frakturkallus quantitativ analysiert. Hierzu wurden in der Region des größten Femurdurchmessers Schnittpräparate in longitudinaler Ausrichtung angefertigt und nach der Masson-Goldner-Methode gefärbt. Nach Digitalisierung mithilfe eines Bildauswertungsprogramms wurden die Fläche des periostalen Kallus sowie die prozentualen Anteile von Knochen-, Knorpel- und Bindegewebe im Gesamtkallus bestimmt. In der biomechanischen Testung wurde die Rotationsstabilität der frakturierten Knochen analysiert. Dazu wurde bei jedem Knochenpräparat der maximale Torsionswinkel sowie das maximale Drehmoment bis zum Brechen des Knochens bestimmt. Aus diesen Werten konnte die maximale Torsionssteifigkeit errechnet werden, die als Vergleichsparameter der beiden Versuchsgruppen herangezogen wurde. Die Western-Blot-Analyse diente zur quantitiativen Analyse der Expression der Angio- und Osteogeneseparameter CD31, CYR61 sowie BMP-2 im Frakturkallus. Zusätzlich erfolgte in beiden Versuchsgruppen nach venöser Blutentnahme eine serologische Bestimmung des Gesamtcholesterins sowie der Triglyzeride mithilfe enzymatisch colorimetrischer Tests. Nach Auswertung der histomorphometrischen, biomechanischen, proteinbiochemischen sowie serologischen Untersuchungen ergaben sich folgende Ergebnisse: I. In der histomorphometrischen Analyse zeigten sich bei den ApoE-Knockout-Mäusen eine signifikant höhere periostale Kallusfläche sowohl zwei als auch vier Wochen nach Frakturierung. II. Die prozentuale Gewebezusammensetzung zeigte zwei Wochen nach Frakturierung bei den ApoE-Knockout-Mäusen einen tendenziell geringeren Anteil an Knochengewebe sowie einen höheren Anteil an Knorpel- und Bindegewebe im Kallusgewebe. III. Nach vier Wochen glichen sich die prozentualen Anteile von Knochen-, Knorpel- sowie Bindegewebe in beiden Versuchsgruppen an. IV. In der biomechanischen Auswertung ergaben sich trotz der größeren Kallusfläche bei den ApoE-Knockout-Mäusen in beiden Gruppen vergleichbare Ergebnisse der Torsionssteifigkeit sowohl nach zwei als auch nach vier Wochen. Daraus lässt sich schließen, dass der zu diesem Zeitpunkt neu gebildete Knochen eine im Vergleich zur Kontrollgruppe verminderte biomechanische Belastbarkeit aufweist. V. Die proteinbiochemische Analyse zeigte eine verminderte Expression der Angio- und Osteogeneseparameter CD31, CYR61 sowie BMP-2 bei den ApoE-Knockout- Mäusen sowohl zwei als auch vier Wochen nach Frakturierung. VI. Die serologische Untersuchung ergab signifikant erhöhte Werte des Serumcholesterins bei den ApoE-Knockout-Mäusen. Zusammenfassend lässt sich aufgrund der oben genannten Ergebnisse sagen, dass bei Vorliegen eines aufgrund einer ApoE-Defizienz atherosklerotisch veränderten Gefäßsystems das Kallusremodelling während der Frakturheilung verzögert abläuft. Dies äußert sich in einer signifikant vergrößerten Kallusfläche sowohl zwei als auch vier Wochen nach Frakturierung des Knochens. Die verringerte Expression von CD31, CYR61 sowie BMP-2 deuten auf eine gestörte Angio- und Osteogenese bei den ApoE-defizienten-Tieren hin, was in Korrelation zum verzögerten Kallus-Remodelling steht.

Recent studies have shown that the two common diseases of atherosclerosis and osteoporosis often coexist in patients. Thus, oxidized lipids not only seem to be involved in the pathogenesis of atherosclerosis but also favor the development of osteoporosis. This is probably due to inhibition of osteoblast differentiation by oxidized lipids. However, atherosclerotic plaques also express growth factors that are important for bone mineralization and angiogenesis during fracture healing. So far, to our knowledge, there has been no insight into the extent to which pre-existing atherosclerotic vascular lesions affect bone healing. We aimed to shed light onto the influence of atherosclerotic vascular lesions on bone healing using an animal model study. The results of the present study could lead to new therapeutic approaches to fracture treatment. As is known from previous animal studies, a mutation in the apolipoprotein E gene leads to hyperlipidemia and thereby to pronounced atherosclerotic vascular lesions in the organism. For the present study, 43 apo E knockout mice are used as animal model. As a control served 44 C57BL/6 mice, the corresponding wild type. After inducing a closed fracture of the right femur with subsequent stabilization by an intramedullary screw, the animals were sacrificed after 2 or 4 weeks by phenobarbital overdose. Following this, further histomorphometric, biomechanical and protein biochemistry studies were performed on the resected femora. In the histomorphometric analysis the size and tissue composition of the fracture callus were analyzed quantitatively. For this purpose longitudinal sections were made in the region of the maximum femoral diameter and stained according to the Masson Goldner method. After digitalisation, for each specimen, the periosteal callus area as well as the percentage of bone, cartilage and fibrous tissue of the total callus area were determined using an image evalulation program. For biomechanical testing, the rotational stability of the fractured bones was analysed. For this purpose, the maximum torsion angle and the maximum torque were determined for each bone. From these values, the maximum torsional stiffness was calculated, which was used for comparison of the experimental groups. The Western blot analysis was used for quantitative analysis of the expression of the angio- and osteogenesis markers CD31, CYR61 and BMP-2 in the fracture callus. In addition, a serological analysis of the total cholesterol and triglycerides was carried out by enzymatic colorimetric tests in both experimental groups after venous blood sampling. After the evaluation of the histomorphometric, biomechanical, biochemical and serological analysis, the results were as follows: I. In the histomorphometric analysis apoE knockout mice showed a significantly increased periosteal callus area at both 2 and 4 weeks after fracture. II. Two weeks after the fracture the tissue composition tended to show a lower percentage of bone tissue and a higher proportion of cartilage and fibrous tissue in the callus area of the femora of apoE knockout mice. III. After 4 weeks, the percentages of bone, cartilage and fibrous tissue were similar in both experimental groups. IV. In the biomechanical evaluation, comparable results of torsional stiffness were observed in both groups after 2 and 4 weeks despite the significantly larger callus area in the apoE knockout mice. This indicates, that the newly formed bone in apoE knockout mice is of reduced biomechanical resilience when compared to the control group. V. The biochemical analysis showed a decreased expression of the angio- and osteogenic markers CD31, CYR61 and BMP-2 in the callus of apoE knockout mice both 2 and 4 weeks after fracture. VI. The serological examination revealed significantly elevated levels of serum cholesterol in the apoE knockout mice. In summary, based on the above results, it can be concluded that apoE-deficiency and, consequently the atherosclerotic lesions of the vascular system, are associated with a delay in callus remodelling during fracture repair. This is reflected by the significantly larger callus area at both 2 and 4 weeks as well as the lower bone content and higher proportion of cartilage tissue after 2 weeks in the callus of apoE knockout mice. The lower expression of CD31, CYR61 and BMP-2 in apoE knockout mice indicates a disruption of angio- and osteogenesis, leading to a delayed callus remodeling.