Die Auswirkungen von Erythropoese-stimulierenden Substanzen auf die Revaskularisierung transplantierter Langerhans’scher Inseln

Abstract

Die Transplantation Langerhans‘ scher Inseln stellt eine vielversprechende Therapiestrategie zur kurativen Behandlung des Diabetes mellitus dar. Sie konnte sich im klinischen Alltag bisher allerdings nicht durchsetzen. Aufgrund der niedrigen Anwachsrate der Transplantate kann eine langfristige Insulinunabhängigkeit der Patienten bisher nicht gewährleistet werden. In den ersten Tagen nach Transplantation sind die Langerhans’schen Inseln durch das fehlende Gefäßnetzwerk hypoxischen Bedingungen ausgesetzt. Dies wiederum führt zu Zellnekrosen und schließlich zum Verlust der Transplantate. Erythropoietin (EPO), der Hauptregulator der Erythropoese, und das langwirksame Analagon Darbepoetin-α (DPO) sind bekannt für ihre pro-angiogenen Eigenschaften. Aus diesem Grund sollte in der vorliegenden Arbeit untersucht werden, ob diese Erythropoese-stimulierenden Substanzen in der Lage sind, die Revaskularisierung von transplantierten Inseln zu beschleunigen und zu verbessern. Als Spendertiere dienten FVB/N-TgN (Tie2/ green light fluorescence protein (GFP)) 287 Sato Mäuse, um zusätzlich Erkenntnisse über den Anteil an spendereigenen Endothelzellen am Gefäßnetzwerk der Transplantate zu gewinnen. FVB/N-Wildtyp Mäuse dienten als Empfängertiere. Zur Analyse der Revaskularisierung wurde das Rückenhautkammer Modell verwendet, das repetitive intravitale fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen zur Mikrozirkulation transplantierter Langerhans’scher Inseln ermöglicht. Zusätzlich wurden die Transplantate histologisch und immunhistochemisch untersucht und der Hämatokrit der Empfängertiere bestimmt. In der ersten Versuchsreihe wurden frisch isolierte Langerhans’sche Inseln in die Rückenhautkammer von Empfängertieren transplantiert, die ab dem Tag der Transplantation täglich mit EPO (500 IU/kg) behandelt wurden. Kontrollen erhielten täglich NaCl. An Tag 6 nach Transplantation zeigten Inseln der EPO-Gruppe eine erhöhte funktionelle Kapillardichte und ein vergrößertes mikrovaskuläres Netzwerk im Vergleich zu Inseln der Kontrollgruppe. Allerdings hatte die Behandlung keine Auswirkungen auf die Anwachsrate der Transplantate und führte zu einer signifikanten Erhöhung des Hämatokrits in den Empfängertieren. Da DPO eine größere biologische Aktivität und längere Halbwertszeit als EPO besitzt, wurde in einer zweiten Versuchsreihe die Empfängertiere ab dem Tag der Transplantation alle drei Tage mit DPO (2,5 μg/kg), DPO (10 μg/kg) behandelt. Kontrollen erhielten alle drei Tage NaCl. Die intravital-mikroskopische Analyse zeigte keine Unterschiede in der Revaskularisierung der Transplantate zwischen den drei experimentellen Gruppen. Allerdings kam es in der DPO-Hochdosis-Gruppe zu einem signifikant erhöhten mikrovaskulären Blutvolumenfluss und Hämatokritanstieg an Tag 14 im Vergleich zur DPO-Niedrigdosis-Gruppe und Kontrollgruppe. Um den Wirkspiegel von EPO in den ersten Tagen nach Transplantation zu erhöhen, wurde in einem dritten Studienabschnitt die Empfängertiere, 6 Tage lang vor der Transplantation täglich mit EPO (500 IU/kg) behandelt. Kontrollen erhielten täglich NaCl. Diese Behandlungsstrategie führte zu einer deutlichen Beschleunigung der Revaskularisierung der Transplantate. Dies war an einer signifikant erhöhten funktionellen Kapillardichte an den Tagen 3-10 im Vergleich zur Kontrollgruppe zu erkennen. Auch die relative Größe des Gefäßnetzwerkes, die endokrine Revaskularisierung, der mikrovaskuläre Volumenfluss und die Anwachsrate der Transplantate zeigten signifikante Verbesserungen in der EPO vorbehandelten Gruppe, ohne dabei den Hämatokrit der Empfängertiere zu erhöhen. Interessanterweise zeigte die histologische Untersuchung außerdem einen kleineren Anteil an GFP-positiven Endothelzellen in den Transplantaten der EPO vorbehandelten Tieren, was auf ein zusätzliches Einwachsen von Endothelzellen aus dem umliegenden Gewebe schließen lässt. Aus den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit kann man schlussfolgern, dass die Behandlung der Empfängertiere mit EPO zu einer Beschleunigung der Revaskularisierung führt. Die Behandlung mit DPO erhöht dagegen den mikrovaskulären Blutvolumenfluss der Transplantate. Diese positiven Effekte auf den Anwachsprozess der transplantierten Langerhans’schen Inseln gehen allerdings mit einem erhöhten Hämatokrit der Empfängertiere und damit mit einem erhöhten Thromboserisiko einher. Die EPO-Vorbehandlung dagegen zeigte eine deutliche Beschleunigung der Revaskularisierung mit einer erhöhten Anwachsrate der Transplantate, ohne dabei den systemischen Hämatokrit der Empfänger zu erhöhen. Damit könnte die EPO-Vorbehandlung eine vielversprechende Therapieoption sein, die Erfolgsrate der Transplantation Langerhans’scher Inseln zu verbessern.

The effects of erythropoiesis-stimulating agents on the revascularization of transplanted islets of Langerhans Pancreatic islet transplantation is a promising therapeutic approach to cure diabetes mellitus. However, it does not represent a standard procedure in clinical practice. A low take rate of the transplants is most probably the cause for the lack of a long term insulin independency in these patients. During the first days after transplantation the islets lack a vascular supply and are exposed to hypoxic conditions. This in turn leads to cell necrosis and loss of the transplants. Erythropoietin (EPO), the main regulator of erythropoiesis, and its long lasting analogue Darbepoetin-α (DPO) are known for their pro-angiogenic properties. Therefore, the present study examined if these erythropoiesis-stimulating agents are capable of accelerating and improving the revascularization of transplanted islets of Langerhans. FVB/N-TgN (Tie2/GFP) 287 Sato mice were used as donor animals to achieve additional information on the origin of the endothelial cells in the newly formed microvascular networks of the transplants. FVB/N-wildtype mice were used as recipient animals. The revascularization of the islets was analyzed by repetitive intravital fluorescence microscopy using the dorsal skinfold chamber model. Additionally, the transplants were analyzed by histology and immunohistochemistry. Finally, the hematocrit levels of the recipient animals were determined. In a first set of experiments the freshly isolated islets of Langerhans were transplanted into the dorsal skinfold chamber of recipient animals, treated daily with EPO (500 IU/kg) or NaCl (controls) from the day of transplantation for 14 day. The results showed a significant higher functional capillary density and a greater relative size of the vascular network on day 6 in the EPO-treated animals when compared to controls. However, the treatment had no effect on the take rate of the transplants and, as a side effect, increased the systemic hematocrit levels in the recipient animals. Because DPO has a greater biological activity and a longer half-time life compared to EPO, a second set of experiments with DPO was performed. In these experiments the recipient animals were treated for a 2 week period every three days, either with DPO low dose (2.5 μg/kg), DPO high dose (10 μg/kg) or NaCl (controls) starting from the day of transplantation. The results showed no differences in islet revascularization between the three experimental groups. However, DPO high dose treatment led to an increased microvascular blood volume flow and elevated the systemic hematocrit level of the recipient animals on day 14 when compared to DPO low dose animals and controls. To increase the pro-angiogenic effect of EPO in the first days after transplantation, a third set of experiments was performed. Recipient mice were pretreated daily with EPO (500 IU/kg) or NaCl (controls), starting 6 days prior to islet transplantation. This pretreatment provoked a marked acceleration of the revascularization of the transplants. This was indicated by an increased functional capillary density on days 3-10 when compared to controls. Also, the relative size of the mircrovascular network, the endocrine revascularization, the microvascular blood volume flow and the take rate of the transplants showed a significant improvement in the EPO-pretreatment group. This was achieved without an increase of the systemic hematocrit levels in the recipient animals. Interestingly, the immunohistological analysis revealed a lower fraction of GFP-positive endothelial cells in the transplants of the EPO-pretreated animals on day 6. This indicates an increased ingrowth of GFP-negative endothelial cells from the surrounding host tissue. In conclusion, the present data suggest that treatment of recipient animals with EPO slightly accelerates the revascularization of islet transplants. In contrast DPO treatment results in an increased microvascular blood volume flow of the transplants. However, these positive effects on the engraftment of transplanted islets were accompanied by an elevation of the systemic hematocrit levels of the recipient animals. Therefore, the use of these treatment strategies could lead to a higher risk of thromboembolic events. EPO-pretreatment, on the other hand, led to a marked acceleration of the islet revascularization. This was associated with a higher number of successfully engrafted islets, without an increase of the systemic hematocrit levels of the recipients. Therefore, EPO-pretreatment, may represent an interesting therapeutic approach to improve the clinical outcome of islet transplantation.