Adipose tissue-derived microvascular fragments : a novel prevascularization strategy in skin tissue engineering

Abstract

Full-thickness skin defects after burns, infection, trauma or tumor resection are a frequent challenge in reconstructive surgery. Most defects can be treated by means of autologous split-thickness skin grafts (STSG), which are the gold standard for the reconstruction of extensive skin loss. However, wounds above bradytrophic structures, such as tendons and bones, commonly do not exhibit a sufficient vascularization capacity to be covered with STSG alone. Moreover, STSG coverage is prone to restrictive scarring with subsequent functional and esthetic restrictions. Consequently, off-the-shelf dermal skin substitutes have been introduced for the restoration of the dermal layer. For instance, the clinically established Integra is characterized by an engineered collagen-glycosaminoglycan matrix, which provides guidance for infiltrating host cells with subsequent formation of a microvascular network. Stable revascularization of the implant requires ~ 21 days, and only after this period, STSG coverage can be performed. Importantly, this delayed vascularization kinetics is associated with high costs, two surgeries and an increased risk of infection with implant loosening. One approach to overcome this problem is prevascularization, i.e. the induction of a functional microvascular network within the matrix before implantation into a host organism. In the present thesis, adipose tissue-derived microvascular fragments (ad-MVF) are introduced as a novel prevascularization strategy for dermal skin substitutes. In contrast to adipose tissue-derived single cell isolates, ad-MVF consist of intact arteriolar, capillary and venular fragments and only have to reconnect to each other and the host microvasculature for the formation of a functional microvascular network. This work is based on three original articles investigating the isolation process of ad-MVF, their in vitro characterization and the in vivo application of ad-MVF-prevascularized Integra in two murine wound models. In the first study of this thesis, a standardized protocol for the enzymatic isolation of ad-MVF from epididymal fat pads of mice is reported. The fat pads of transgenic green fluorescence protein (GFP)+ C57BL/6 mice were harvested for the isolation of ad-MVF, which were subsequently characterized by means of microscopy, histology, immunohistochemistry and flow cytometry. The total time required for the isolation process was ~ 120 min. It was possible to isolate ~ 40,000 ad-MVF per mL adipose tissue. Individual fragments exhibited a mean length of 42 ± 1 μm. Moreover, they were characterized by a typical microvessel morphology with hierarchical vessel segments as indicated by immunohistochemical analyses. Flow cytometry revealed that ad-MVF contain 26 ± 2 % CD31+ endothelial cells, 17 ± 2 % α-smooth muscle actin (SMA)+ perivascular cells and 9 ± 1 % cells positive for the mesenchymal stem cell marker CD117. Pilot experiments with ad-MVF-seeding onto Integra indicated that the fragments were mainly localized on the implant's surface and only a few capillary vessel segments could be detected within its pores immediately after the seeding process. In the second study of this thesis, Integra seeded with GFP+ ad-MVF was investigated after implantation into full-thickness skin defects in a modified dorsal skinfold chamber model of wild-type C57BL/6 mice. Non-seeded implants served as controls. The in vivo experiments consisted of a 14 days-observation period with repetitive intravital fluorescence microscopy and stereomicroscopy for the assessment of the implants' vascularization and epithelialization. After 14 days, histological and immunohistochemical analyses of vascularization, lymphangiogenesis, epithelialization and collagen content were performed. The GFP+/GFP- crossover approach allowed the identification of ad-MVF-derived blood and lymphatic vessels in the implants as well as in the surrounding skin. The ad-MVF rapidly reassembled into microvascular networks within the implants and inosculated to the host microvasculature between day 3 and 6 after transplantation. Accordingly, the vascularization of the implants was markedly accelerated, as indicated by a significantly higher microvessel density when compared to controls. Moreover, dense lymphatic networks originating from the GFP+ ad-MVF developed within the implants. The GFP+ blood and lymphatic vessels even invaded the surrounding skin. Finally, enhanced vascularization and lymphangiogenesis resulted in an increased implant integration and epithelialization.

In the third study of this thesis, ad-MVF-based prevascularization of Integra was analyzed in a novel animal model. In a first set of experiments, Integra seeded with GFP+ ad-MVF was implanted into full-thickness skin defects on the skull of CD1 nu/nu mice for 21 days. Non-seeded implants served as controls. The implants were assessed in situ by means of photo-acoustic imaging. At the end of the in vivo experiments, vascularization, lymphangiogenesis as well as incorporation of the implants were analyzed using trans-illumination stereomicroscopy, histology and immunohistochemistry. In a second set of experiments, early autologous STSG coverage was performed 10 days after implantation of prevascularized and non-seeded Integra. The survival rate of STSG was assessed by planimetry and 5 days after STSG transplantation, the implants and the STSG were excised for histological and immunohistochemical analyses. After 21 days, the density of microvascular and lymphatic networks was markedly higher in prevascularized matrices when compared to controls. This was associated with an improved integration of the implants. Moreover, prevascularization with ad-MVF allowed successful STSG coverage already at day 10. In contrast, skin grafting of non-seeded controls resulted in STSG necrosis.

In summary, ad-MVF-seeding represents a novel and promising prevascularization strategy for the dermal skin substitute Integra. Murine ad-MVF enhance the vascularization and lymphangiogenesis of Integra and also result in a faster integration and epithelialization of the implant. Key advantages of ad-MVF prevascularization are the short isolation time and the intact microvascular characteristics, which are prerequisites for an intraoperative one-staged application. However, from a translational perspective, it has to be proven that ad-MVF harvested from subcutaneous adipose tissue of humans exhibit an equally high vascularization capacity compared with murine ad-MVF. If this holds true, ad-MVF may soon be taken from bench to bedside.

Ausgedehnte Hautdefekte sind ein häufiges Problem in der rekonstruktiven Chirurgie. Der Goldstandard für die Behandlung der meisten Hautdefekte ist die autologe Spalthauttransplantation. Gewisse Defekte sind aber einer Spalthautdeckung nicht zugänglich. So sind die dünnen Hauttransplantate nicht geeignet für die Deckung von Wunden mit schlecht vaskularisiertem Wundgrund, zum Beispiel bei freiliegenden Sehnen oder Knochen. Ein weiteres relevantes Problem ist die Ausbildung von funktionellen und kosmetisch invalidisierenden Narbenkontrakturen. Biosynthetische dermale Ersatzmatrizen, wie das klinisch oft verwendete Integra, stellen eine Möglichkeit dar, diese Probleme zu umgehen. Integra besteht aus einer Kollagen-Glycosaminoglycan Matrix, in welche ein mikrovaskuläres Gefäßnetzwerk aus dem umgebenden Empfängergewebe vor einer Spalthautdeckung einsprossen muss. Dieser Prozess benötigt ungefähr 3 Wochen. Danach kann die Matrix mit Spalthaut gedeckt werden. Diese verzögerte Vaskularisierung resultiert in zwei operativen Eingriffen, in einem erhöhten Infektionsrisiko mit möglichem Implantatverlust sowie in hohen Kosten. Ein möglicher Lösungsansatz für dieses Problem basiert auf dem Prinzip der Prävaskularisierung. Der Begriff stammt aus dem Tissue Engineering und bedeutet die Induktion eines funktionellen Gefäßnetzwerkes in einem Gewebekonstrukt vor Implantation in einen Empfängerorganismus. In der vorliegenden Arbeit werden aus Fettgewebe isolierte mikrovaskuläre Fragmente (ad-MVF) als vielversprechende Prävaskularisierungs-Strategie für dermale Matrizen eingeführt. ad-MVF bestehen aus intakten arteriolären, kapillären und venulären Gefäßfragmenten, welche sich nach Implantation in einen Empfängerorganismus lediglich wieder zu einem mikrovaskulären Netzwerk verbinden müssen. Dies unterscheidet sie wesentlich von Einzelzell-basierten Isolaten aus Fettgewebe, wie zum Beispiel der stromal vascular fraction, die ebenfalls häufig für die Prävaskularisierung von Implantaten verwendet wird. Diese Arbeit beruht auf drei Originalarbeiten, welche die Isolation von ad-MVF, deren in vitro Charakterisierung sowie die in vivo Anwendung von mit ad-MVF prävaskularisiertem Integra in zwei Mausmodellen beschreiben. In der ersten Studie wird ein ein standardisiertes Protokoll für die Isolation von ad-MVF aus epididymalem Fettgewebe von Mäusen beschrieben. Hierfür wurden ad-MVF von transgenen, green fluorescent protein (GFP)+ C57BL/6 Mäusen enzymatisch isoliert und mittels Mikroskopie, Histologie, Immunhistochemie und Durchflusszytometrie charakterisiert. Die Gesamtzeit für die Isolation betrug ~ 120 Minuten. Es konnten ~ 40,000 ad-MVF pro ml Fettgewebe gewonnen werden. Die einzelnen Fragmente wiesen eine durchschnittliche Z u s a m m e n f a s s u n g | 5 Länge von 42 ± 1 μm und eine typische mikrovaskuläre Morphologie auf. Durchflusszytometrische Analysen zeigten, dass ad-MVF 26 ± 2 % CD31+ Endothelzellen, 17 ± 2 % α-smooth muscle actin (SMA)+ perivaskuläre Zellen und 9 ± 1 % mesenchymale Stammzellen charakterisierende CD117+ Zellen enthalten. In Pilotversuchen wurden ad-MVF auf Integra gesiedelt. Auf diese Weise konnte histologisch gezeigt werden, dass der überwiegende Anteil der ad-MVF auf der Oberfläche des Implantates lokalisiert war und nur wenige kapilläre ad-MVF in die Poren von Integra eindringen konnten. In der zweiten Studie wurde prävaskularisiertes Integra in Hautdefekten in einer modifizierten Rückenhautkammer an C57BL/6 Mäusen untersucht. Hierfür wurden die Implantate mit GFP+ ad-MVF besiedelt. So konnte nach Implantation in GFP- C57BL/6 Tiere zwischen GFP- Empfängergefäßen und GFP+ Gefäßen, die sich aus den ad-MVF entwickelten, unterschieden werden. Die Kontrollgruppe bestand aus unbesiedelten Implantaten. Während eines 14-tägigen in vivo Versuches wurden die Vaskularisierung und Epithelialiserung der Implantate mittels intravitaler Fluoreszenzmikroskopie sowie stereomikroskopischer Planimetrie erfasst. Nach 14 Tagen wurden die Implantate für die histologische und immunhistochemische Analyse der Vaskularisierung, Lymphangiogenese und Epithelialisierung sowie für die Quantifizierung des Kollagengehaltes entnommen. Interessanterweise bildeten die ad-MVF in kurzer Zeit innerhalb des Integra ein funktionelles Gefäßnetzwerk aus, welches über Inoskulation nach 3 - 6 Tagen Anschluss an die Gefäße des Empfängergewebes fand. Entsprechend konnte in den prävaskularisierten Implantaten eine deutlich verbesserte Vaskularisierung mit signifikant höherer mikrovaskulärer Dichte im Vergleich zu den nicht-besiedelten Implantaten der Kontrollgruppe nachgewiesen werden. Weiterhin wiesen die ad-MVF-besiedelten Implantate auch ein deutlich dichteres Lymphgefäßnetzwerk auf. GFP+ Blut- und Lymphgefäße waren nicht nur in den Implantaten, sondern auch im umliegenden Empfängergewebe nachweisbar. Die verbesserte Vaskularisierung und Lymphangiogenese führten letztlich zu einer verstärkten Integration und Epithelialisierung der dermalen Matrizen. In der dritten Studie wurde ad-MVF-prävaskularisiertes Integra hinsichtlich einer vorzeitigen Spalthautdeckung in einem neuen Mausmodell untersucht. Die Hypothese dieser Studie lautete, dass durch die Prävaskularisierung eine Spalthautdeckung früher möglich ist. Hierfür wurden in einem ersten Studienabschnitt besiedeltes und unbesiedeltes Integra in einen Hautdefekt auf dem Schädel von CD1 nu/nu Mäusen über 21 Tage implantiert. Während des in vivo Versuches wurde die Vaskularisierung der Implantate mittels Photoakustik analysiert. Nach Entnahme der Implantate wurden Vaskularisierung, Lymphangiogenese sowie die Gewebeintegration mittels Transilluminations-Stereomikroskopie, Histologie und Immunhistochemie erfasst. In einem zweiten Studienabschnitt wurden prävaskularisiertes Z u s a m m e n f a s s u n g | 6 und nicht-prävaskularisiertes Integra 10 Tage nach Implantation mit autologen Spalthauttransplantaten gedeckt und für 5 weitere Tage mittels stereomikroskopischer Planimetrie untersucht. So konnte die prozentuale Überlebensrate der Transplantate objektiviert werden. Die Präparate wurden anschließend histologisch und immunhistochemisch ausgewertet. Nach 21 Tagen wiesen die prävaskularisierten Implantate analog zur zweiten Studie ein signifikant dichteres Blut- und Lymphgefäßnetzwerk im Vergleich zu den nicht-besiedelten Implantaten der Kontrollgruppe auf. Dies ging mit einer verbesserten Integration in das Gewebe einher. Die vorzeitige Spalthauttransplantation war nur auf den prävaskularisierten Implantaten möglich, wohingegen die Hauttransplantate auf den unbesiedelten Implantaten der Kontrollgruppe nekrotisch wurden. Abschließend kann festgehalten werden, dass murine ad-MVF eine vielversprechende Prävaskularisierungs-Strategie für dermale Ersatzmatrizen darstellen. Sie verbessern nicht nur die Ausbildung von Blut- und Lymphgefäßen innerhalb von Integra, sondern sind auch mit einer schnelleren Integration und Epithelialisierung der Implantate assoziiert. Von grosser Bedeutung sind die kurze Isolationszeit sowie die erhaltene mikrovaskuläre Morphologie der ad-MVF. Diese Punkte stellen eine conditio sine qua non für eine einzeitige intraoperative Anwendung dar. Aus der Perspektive des Klinikers müssen zukünftige Versuche zeigen, ob ad-MVF aus humanem Fettgewebe ein vergleichbar hohes Vaskularisierungspotential aufweisen. Dann wären ad-MVF-prävaskularisierte dermale Ersatzmatrizen in der Tat ein interessanter Therapieansatz für therapie-refraktäre chronische Wunden.