Please use this identifier to cite or link to this item: doi:10.22028/D291-32334
Title: MALDI-ToF basierte Frühdiagnostik Carbapenemase-positiver gramnegativer Bakterien
Author(s): Bauer, Kim Jens
Language: German
Year of Publication: 2017
Place of publication: Homburg/Saar
SWD key words: Frühdiagnostik
Bakterien
DDC notations: 610 Medicine and health
Publikation type: Doctoral Thesis
Abstract: Einleitung: Die zunehmende Ausbreitung von multiresistenten Bakterien ist eine globale Herausforderung und bedarf zwingend schneller, sensitiver und einfach durchführbarer Diagnostik. MALDI-ToF basierte Diagnostik gramnegativer Carbapenemase-positiver Erreger ist eine Technologie, die in der Lage ist Carbapenemresistenzen frühzeitig zu identifizieren und wird bereits in einigen Laboratorien als Screeningmethode eingesetzt. Bisher mangelt es jedoch an standardisierten Arbeitsprotokollen, welche für einen großflächigen Einsatz dieses Testverfahrens in der Routinediagnostik notwendig sind. Methodik: In der vorliegenden Arbeit wurde ein standarisiertes auf „ready-to-use“ Reagenzien basierendes MALDI-ToF (Bruker Daltonics) Arbeitsprotokoll zur Einführung dieser Methode in die Routinediagnostik unter Verwendung von Ertapenem ausgearbeitet. Es erfolgte eine automatisierte bioinformatische Auswertung (Bionumerics 7.5) der Messergebnisse durch Berechnung einer Ratio anhand des Ertapenem-Reinspektrums und dem Spektrum seiner Abbauprodukte. Der Arbeitsablauf des eigens entwickelten Protokolls inklusive automatisierter bioinformatischer Auswertung wurde zunächst an 30 genotypisierten Proben des Nationalen Referenzzentrums für gramnegative Erreger (NRZ) in Triplikaten getestet. Die Ergebnisse wurde mit Triplikaten phänotypischer Tests (Hodge-Test; MAST-Carbapenemase-Detektionsset) verglichen. Nach Erhöhung des für die Messung verwendeten Probenmaterials pro Erreger fand eine Validierung an 64 laboreigenen, sowie weiteren 64 Stämmen des NRZ statt. Insgesamt wurden 158 verschiedene Erreger getestet, die sich aus 112 Carbapenemase-positiven (IMP-, KPC-, NDM-, VIM-, GIM-, OXA-Carbapenemasen), sowie 46 Carbapenemase-negativen Erregern zusammensetzten. In kinetischen Folgemessungen wurden optimale Messpunkte im Hinblick auf schnellstmögliche Identifizierung Carbapenemase-positiver Erreger bei höchstmöglicher diagnostischer Sicherheit identifiziert. Die „hands-on“-Zeit betrug für eine Probe etwa 20 Minuten, bei nur geringem Mehraufwand für die gleichzeitige Testung mehrerer Messproben. Ergebnisse In der Vergleichsmessung mit gängigen phänotypischen Methoden in Triplikaten anhand 30 genotypisierter Stämme konnte mittels des entwickelten Verfahrens nach 24h eine Sensitivität von 91,75% erzielt werden. Die durchgeführten phänotypischen Methoden erzielten eine Sensitivität 84,71% (Hodge-Test) und 83,90% (MAST-Carbapenemase-Detektionsset). In der Gesamtanalyse aller 158 Messproben konnte bereits nach 2h Stunden für alle getesteten Carbapenemasen mit Ausnahme von OXA- und GIM-Carbapenemasen eine Sensitivität von 100% erzielt werden. Die Spezifität des Testverfahrens betrug nach 2h ebenfalls 100%. Nach 24 stündiger Inkubation lag die Sensitivität für alle Carbapenemasen einschließlich OXA- und GIM-Carbapenemasen bei 100%. Die Spezifität betrug 73,81%. Die automatisierte Auswertung mit Hilfe eines eigens entwickelten bioinformatischen Scripts (Bionumerics 7.5) erlaubte eine eindeutige Differenzierung zwischen Carbapenemase-positiven und Carbapenemase-negativen Messproben Schlussfolgerung Das entwickelte Arbeitsprotokoll erlaubt mit Hilfe von ready-to-use Reagenzien, MALDI-ToF basierter Carbapenemase-Detektion und automatisierter bioinformatischer Auswertung der Massenspektren eine schnelle, reproduzierbare Carbapenemase-Identifikation mit hoher Sensitivität und Spezifität, bei gleichzeitig hohem Standardisierungsgrad und niedriger hands-on-Zeit. Das entwickelte Arbeitsprotokoll eignet sich zum Carbapenemase-Screening bei unbekannten Erregern, da im Gegensatz zu genotypischen Methoden (PCR) alle bekannten Carbapenemasen erfasst werden.
Objektives Spreading of multiresistant bacteria has become an increasing problem worldwide and requires fast, sensitive and reproducible detection assays. MALDI-ToF can be applied as a promising method for detection of carbapenemase-positive strains in specialized laboratories. However, standardized ready-to-use protocols are required for widespread diagnostic application. Methods: In the present study we optimized a standardized workflow for routine diagnostics using ready-to-use reagents and subsequent detection of ertapenem digestion profiles using MALDI–ToF (Bruker Daltonics) followed by automated analysis of mass-spectra (digested vs. undigested antibiotic peaks) with automated reading of ertapenem digestion profiles (Bionumerics 7.5). At first 30 genotyped strains of the National Reference Laboratory for multidrug-resistant gramnegative bacteria (NRZ) were tested and compared to standard phenotypic methods (Hodge-Test; MAST-Carbapenemase-Detection-Kit). The diagnostic assay was performed in triplicates. For validation of the MALDI-ToF based workflow and automated evaluation additional 64 strains of our laboratory and further 64 strains from the NRZ were tested. Overall 158 gramnegative genotyped bacteria including 112 carbapenem-resistant strains with different genotypic resistance profiles (IMP-, KPC-, NDM-, VIM-, GIM-, OXA-Types) and 46 carbapenem-sensitive strains passed through the new MALDI-ToF assay. Time kinetics was applied to achieve best time points for future routine testing. Results The hands-on time per tested strain was about 20min, with just minor additional effort for testing several strains at the same time. Comparing the new standardized MALDI-ToF assay with established phenotypic methods using 30 genotyped strains from the NRZ which were tested three times each a sensitivity of 91,75% was achieved by MALDI-ToF after 24 hours whereas Hodge-Test achieved 84,71% and MAST Carbapenemase-Detection-Kit achieved 83,90%. Analyzing the results of all 158 tested strains after two hours of incubation a sensitivity and specificity of 100% for the majority carbapenemases was achieved while delayed carbapenemase activity was observed for OXA- and GIM-type isolates. After 24 hours of incubation the sensitivity for all carbapenemases including OXA- and GIM-type was 100%. The specificity after 24 hours was 73,81%. Automated evaluation by a custom bioinformatical script (Bionumerics 7.5) allowed unibased discrimination between carbapenemase-positive and negative strains. Conclusion: The new established carbapenemase assay using ertapenem ready-to-use reagents, MALDI-ToF analysis of carbapenemase activity and automated evaluation of digestion profiles allows reproducible, fast, sensitive and specific detection of carbapenemase positive isolates, with a high grade of standardization and a limited hands-on-time. The workflow is suitable for universal carbapenemase-screening while genotypic methods (PCR) are focused on specific carbapenemase genotypes.
Link to this record: urn:nbn:de:bsz:291--ds-323341
hdl:20.500.11880/29732
http://dx.doi.org/10.22028/D291-32334
Advisor: von Müller, Lutz
Date of oral examination: 11-Nov-2019
Date of registration: 23-Sep-2020
Faculty: M - Medizinische Fakultät
Department: M - Infektionsmedizin
Professorship: M - Prof. Dr. Dr. Sören Becker
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