Rolle der Telomerase und zellulärer Seneszenz beim myokardialen Remodeling nach experimenteller Myokardischämie in Mäusen

Abstract

Die Zellalterung könnte für das so genannte myokardiale Remodeling, also einen Anpassungsprozess des Herzmuskels nach kardialer Schädigung, eine wichtige Rolle spielen. Die komplexe Regulation von Vorgängen wie Zellüberleben / Apoptose, Zellproliferation, Fibrose und Seneszenz betreffen nicht nur die primär von dem kardialen Schaden betroffenen Zellen des Myokards, sondern involvieren auch Einwanderung und Überleben von extrakardialen Zellen wie Entzündungszellen mit dem Ziel der Heilung, Narbenbildung und Regeneration. Telomere und telomer-regulierende Proteine wie Telomerase und telomeric repeat-binding factor 2 (TRF2) sind nicht nur für die Steuerung und Kontrolle der Zellalterung wichtig, sondern interagieren bekanntermaßen mit allen o.g. Vorgängen. Durch das Modell der experimentellen Myokardischämie (MI) mittels Ligatur der proximalen left anterior descending (LAD) artery in Mäusen ist es möglich, diese bislang wenig erforschten Mechanismen der Zellalterung nach einem Herzinfarkt besser zu verstehen. Dies war das Hauptziel der vorliegenden Promotionsarbeit, in der, neben der Erforschung der kardialen Regulation der Telomerparameter bei genetisch unveränderten Tieren, die kausale Rolle der Telomerase sowohl für das myokardiale Remodeling als auch für die Regulation in extrakardialen Organen in Knockout-Mäusen untersucht wurde. Zunächst wurde der Frage nachgegangen, ob es eine zeitlich (Tag 3, 7 und 28) und regional (Infarkt- (IZ) und Randzone (RZ)) unterschiedliche Regulation der Telomerlänge, Telomerase und telomer-assoziierter Proteine nach Induktion eines MI durch proximale LAD-Ligatur gibt. In männlichen, 10-14 Wochen alten C57Bl/6N-Wildtypmäusen (WT) konnten wir mit Hilfe des Telomere-Repeat Amplification Protocol (TRAP)-Assays zeigen, dass initial bloß in der IZ und nicht in der RZ eine signifikante Steigerung der Telomeraseaktivität vorlag. An Tag 7 nach Operation fand sich dann eine weitere Zunahme, wobei dieser Effekt an Tag 28 nur in der IZ noch stärker ausgeprägt war. Die Telomerlänge wurde nach 4 Wochen bestimmt und war in der RZ mehr als in der IZ verlängert. Parallel zur Telomeraseaktivität beobachteten wir gleichzeitig eine Aktivierung anti-seneszenter / anti-apoptotischer (TRF2, pAKT) und pro-seneszenter / pro-apoptotischer (p53, Cell-Cycle Checkpoint Kinase 2 (Chk2), Bax, p16) Signalwege. Diese schien zeitlich begrenzt zu sein mit einem Maximum an Tag 7 nach MI, und sich nach 4 Wochen eine Gegenregulation unter den Ausgangswert (TRF2, p53, Chk2, pAkT) bzw. Rückkehr zur Baseline (Bax) fand. Sirtuin-1 (SIRT1) und p16 hingegen waren beide an Tag 28 nach MI noch deutlich hochreguliert. Des Weiteren wurden drei extrakardiale Organsysteme untersucht: 1.) die Aorta ascendens, weil sich im Rahmen der kardialen Funktionsverschlechterung nach MI durch geänderte Scherkräfte in den zentralen Gefäßen eine zelluläre Regulation ergeben könnte. Die Assays lieferten insgesamt kein valides Ergebnis. 2.) Die Leber, weil dieses Organ zum einen empfindlich auf einen kardialen Rückstau ist, zum anderen eines der hämatopoetischen Organe der Maus und somit Quelle für inflammatorische Zellen und Stammzellen, welche vom Herzen nach einer Ischämie durch Chemokine angelockt werden, ist. Die wichtigsten Befunde waren eine reduzierte Telomeraseaktivität und eine gleichzeitig erhöhte Expression von Bax und SIRT1 in den Infarkttieren. 3.) Die mononukleären Zellen (MNC) der Milz, da sie ebenfalls ein hämatopoetisches Organ in der Maus ist und über die zirkulierenden Zellen an der Infarktheilung teilnimmt. Die Ergebnisse in der heterogenen Population der MNC streuten, ähnlich wie in der Aorta, stark. Es zeigte sich allerdings konsistent eine gesteigerte Telomerlänge nach 4 Wochen, hinweisend auf eine Ausschwemmung von Stammzellen mit langen Telomeren aus dem blutbildenden System. Zusätzlich wurden weibliche, 11-34 Wochen alte Mäuse der 2. Generation (d.h. mit noch nicht verkürzten Telomeren) mit globaler genetischer Defizienz der Telomerase-Reverse-Transkriptase (TERT), der katalytischen Untereinheit der Telomerase, an Tag 28 nach Scheinoperation bzw. MI untersucht. Im Vergleich zu den C57Bl/6N- und den TERT+/+-Tieren zeigten die Infarktmäuse ohne Telomeraseaktivität zum Teil deutliche Unterschiede in der Regulation. Die Telomerlänge und TRF2-Expression waren z.b. in TERT-/--Infarktmäusen nicht verändert, jedoch waren bereits in der TERT-/-- im Vgl. zur TERT+/+-Shamgruppe die pro-apoptotischen Proteine p53 und Bax vermindert und der Seneszenzmarker p16 erhöht, was durch den Infarkt nicht weiter beeinflusst wurde. In histologischen Untersuchungen zeigte sich ebenfalls ein entscheidender Unterschied bei den TERT-defizienten MI-Tieren gegenüber den TERT-positiven Kontrollen: auffällig war eine deutlich vermehrte Myokardfibrose in der Sirius Red-Färbung. Dieser wichtige Befund konnte durch den Nachweis einer gesteigerten Genexpression von Collagen-1α und Connective Tissue Growth Factor (CTGF) molekularbiologisch noch untermauern werden. Die oben genannten Veränderungen der Proteinexpression könnten eine Erklärung für den möglichen Einfluss der TERT-Defizienz auf die Kollagenakkumulation sein. Die Untersuchungen in extrakardialen Geweben führten, ähnlich wie bei den C57Bl/6N-Tieren, zu heterogenen Ergebnissen im Myokard, wiesen aber insgesamt auf eine Störung der extrakardialen Regulation des kardialen Remodeling, z.B. durch fehlenden Nachweis von MNC mit längeren Telomeren bei TERT-/--Infarkttieren hin, während andere Regulationen vergleichbar waren. Eine weitere Fragestellung der Arbeit betraf die funktionellen Konsequenzen der TERT-Defizienz im Kontext des MI. Die Messung der Indices von Herzgewicht / Tibialänge bzw. / Körpergewicht (KG), Lungenfeuchtgewicht / KG und Leberfeuchtgewicht / KG zeigte, dass 4 Wochen nach LAD-Ligatur weder eine Myokardhypertrophie noch eine Herzinsuffizienz vorlagen. Die Kardio-Magnetresonanztomografie (MRT) und der Millar-Katheter verifizierten zwar die kardiale Funktionsminderung mit erniedrigter Pump- bzw. Druckleistung durch den operativ induzierten MI, eindeutige genotypische Unterschiede waren jedoch nicht zu verzeichnen. Dies ist auf den kurzen Zeitpunkt der MRT-Untersuchung 4 Wochen nach dem MI zurückzuführen, welcher bewusst gewählt wurde, um die mittelfristige Regulation nach Herzinfarkt zu beurteilen. Die vorliegende Arbeit führte zu einer Reihe neuer Erkenntnisse mit Fokus auf die Rolle der Telomerase und zellulärer Seneszenzmarker bei Ischämie-induziertem Myokardremodeling in Mäusen. Die Ergebnisse könnten eine Grundlage für die zukünftige Entwicklung neuer therapeutischer Strategien darstellen. Über eine Beeinflussung der Zellalterung wäre es vielleicht möglich, die Entwicklung einer ischämischen Kardiomyopathie als gefürchtete Folgeerscheinung nach MI, die unter anderem durch maladaptives Remodeling verursacht wird, günstig zu beeinflussen.

Role of telomerase and cellular senescence in myocardial remodeling after experimental myocardial ischemia in mice Cell aging may play an important role in myocardial remodeling, which is a process of adaptation of the cardiac muscle following cardiac damage. The complex regulation of mechanisms such as cell survival / apoptosis, cell proliferation, fibrosis and senescence involve not only the cardiac cells affected by the cardiac damage primarily, but also the immigration and survival of extracardiac cells with the aim of healing, scarring and regeneration. Telomeres and telomere-regulating proteins such as telomerase and telomeric repeat-binding factor 2 are not only important for the regulation and control of cell aging, but are also known for interacting with all of the above-mentioned mechanisms. Using the model of experimental myocardial ischemia by ligating the proximal left anterior descending artery in mice makes it possible to better understand these mechanisms of cell aging following a heart infarction, which have been poorly understood so far. This was the main goal of the present doctoral thesis, which investigated, apart from the study of the cardiac regulation of telomeric parameters in genetically unmodified mice, the causal role of telomerase for both the myocardial remodeling and the regulation in extracardiac organs in knockout mice. First, we pursued the question whether there was a temporal (day 3, 7 and 28) and regional (infarct and remote zone) different regulation of telomere length, telomerase and telomere-associated proteins after induction of MI by ligation of the proximal LAD. In male 10- to 14-week-old C57Bl/6N wild-type mice, we were able to demonstrate, using the Telomere Repeat Amplification Protocol assay, that initially there was a significant increase in telomerase activity only in the IZ and not in the RZ. On day 7 after surgery there was a further increase, whereby this effect was even more pronounced on day 28 only in the IZ. The telomere length was determined after 4 weeks and was more extended in the RZ than in the IZ. In parallel to the telomerase activity, we simultaneously observed an activation of anti-senescent / anti-apoptotic (TRF2, pAKT) and pro-senescent / pro-apoptotic (p53, cell-cycle checkpoint kinase 2, Bax, p16) signaling pathways. This seemed to be temporary with a maximum on day 7 after MI, and after 4 weeks a counterregulation was found below baseline (TRF2, p53, Chk2, pAkT) or return to baseline (Bax), respectively. Sirtuin-1 and p16, however, were both significantly upregulated at day 28 after MI. In addition, three extracardiac organ systems were investigated: 1.) the ascending aorta, since cardiac dysfunction after MI with altered shear forces in central vessels could result in a cellular regulation. The assays did not give a valid result. 2.) The liver, because this organ is sensitive to congestion on the one hand, and is one of the hematopoietic organs of the mouse on the other hand, and thus the source of inflammatory and stem cells that are attracted to the heart by chemokines after ischemia. The most important findings were a reduced telomerase activity and a simultaneously increased expression of Bax and SIRT1 in the animals with MI. 3.) The mononuclear cells in the spleen, as it is also a hematopoietic organ in the mouse, participating in infarct healing via the circulating cells. The results in the heterogeneous population of MNC scattered strongly, similar to those in the aorta. However, there was consistently an increased telomere length after 4 weeks, indicating a recruitment of stem cells with long telomeres from the hematopoietic system. Furthermore, female 11- to 34-week-old second generation mice (i.e. with not yet shortened telomeres) with global genetic deficiency of telomerase reverse transcriptase, the catalytic subunit of telomerase, were analyzed on day 28 after sham surgery and MI, respectively. In comparison to the C57Bl/6N and the TERT+/+ animals, mice with MI without telomerase activity showed partially marked differences in the regulation. For example, the telomere length and TRF2 expression were not altered in TERT-/- mice with MI, but in the TERT-/-- in comparison to the TERT+/+- sham group the pro-apoptotic proteins p53 and Bax were decreased and the senescence marker p16 was increased, which was not further influenced by the infarction. In histologic examinations, there was also a crucial difference in TERT-deficient animals with MI versus TERT-positive controls: a significant increase of myocardial fibrosis with the Sirius Red staining. This important finding could be substantiated molecular biologically by demonstrating an increased gene expression of Collagen-1α and Connective Tissue Growth Factor. The above-mentioned alterations of protein expression may be an explanation for the possible influence of TERT deficiency on collagen accumulation. Examinations in extracardiac tissues, similar to the C57Bl/6N animals, resulted in heterogeneous results in the myocardium, but overall indicated an impairment of extracardiac regulation of cardiac remodeling, e.g. lack of MNC with longer telomeres in TERT-/- animals with MI, while other regulations were comparable. Another scientific question of this work concerned with the functional consequences of TERT deficiency in the context of MI. The measurement of the indices of heart weight / tibial length and / body weight, lung wet weight / body weight and liver wet weight / body weight indicated that 4 weeks after LAD ligation neither myocardial hypertrophy nor heart failure was present. Cardiac magnetic resonance imaging and Millar catheter verified cardiac dysfunction with reduced pumping performance and pressure load, respectively, due to surgically induced MI, but there were no clear genotypic differences. This is due to the short time of MRI examination 4 weeks after MI, which was deliberately chosen to assess the mid-term regulation after heart infarction. The present work provided a bunch of new findings focusing on the role of telomerase and cellular senescence markers in ischemia-induced myocardial remodeling in mice. The results could provide a basis for the future development of new therapeutic strategies. By influencing cell aging, it might be possible to favorably influence the development of ischemic cardiomyopathy as a dreaded sequelae of MI caused by maladaptive remodeling, among other things.