Charakterisierung und Quantifizierung alloreaktiver T-Zellen

Abstract

Obwohl präformierte alloreaktive T-Zellen eine akute Abstoßungsreaktion nach Organtransplantation auslösen können, sind bisher keine für die klinische Routine geeigneten Nachweismethoden vorhanden, um das Abstoßungsrisiko abzuschätzen. In dieser Arbeit wurde eine neue Methode zur Identifikation alloreaktiver T-Zellen entwickelt und zur detaillierten Charakterisierung der präformierten Alloreaktivität bei 84 Nieren-, 41 Leber- und 36 Lungeninsuffizienten Patienten sowie bei 190 immungesunden Probanden und bei Schwangeren angewandt. Zur Quantifizierung einer Alloreaktivität eines Empfängers gegen den Spender wurde Vollblut eines Empfängers mit CD45 vorgefärbtem Blut des Spenders für 6 h in einer gemischten Lymphozytenreaktion stimuliert. Der Anteil alloreaktiver CD4 und CD8 T-Zellen wurde durch intrazelluläre Zytokinfärbung mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Als Negativkontrolle diente eine autologe Stimulation, als Positivkontrolle eine polyklonale Stimulation mit bakteriellem Superantigen Staphylococcus aureus Enterotoxin B (SEB). Zusätzlich wurde Blut des Empfängers gegen Blut von mindestens drei nicht blutsverwandten Probanden („Third-Party Stimulatoren“) getestet. Zudem wurden alloreaktive T-Zellen detailliert funktionell und phänotypisch charakterisiert und deren Hemmbarkeit durch Immunsuppressiva in vitro evaluiert. Alloreaktive CD8 T-Zellen traten häufiger und mit höheren Frequenzen auf als alloreaktive CD4 T-Zellen (9,51% vs. 2,66%). Messbare alloreaktive T-Zellen blieben über einen Zeitraum von einem Jahr nachweisbar und waren mittels immunsuppressiver Medikamente hemmbar. Alloreaktive CD8 T-Zellen wurden als Effektor-Memory T-Zellen durch eine fehlende Expression von CD27, CD62L und CCR7 identifiziert. Das Auftreten und die Höhe der alloreaktiven T-Zell Frequenzen zeigte eine Assoziation mit der Anzahl der HLA-Mismatche (p=0,0271). Unter Nieren- und Lungeninsuffizienten Patienten auf der Transplantationswarteliste zeigte sich ein höherer Anteil alloreaktiver T-Zellen als unter Kontrollen und Leberinsuffizienten Patienten (CD4 T-Zellen: Niere 4,06%, Lunge 7,06%, Kontrolle 1,53%, Leber 0,63%; CD8 T-Zellen: Niere 14,80%, Lunge 12,94%, Kontrolle 5,27%, Leber 6,88%). In der Gruppe der niereninsuffizienten Patienten zeigten 5 von 84 Probanden (5,95%) eine hohe CD8 Alloreaktivität gegen die meisten der mitgeführten Third-Party Stimulatorzellen, während 26/84 (30,95%) Patienten eine moderate Alloreaktivität gegen ihre Stimulatoren aufwiesen. Demgegenüber zeigten 53/84 (63,10%) Patienten keine zelluläre Alloreaktivität. Im klinischen Setting einer Transplantation zeigten drei der 55 Nierentransplantierten eine humorale Abstoßungsreaktion. Bei keinem Patienten mit einer humoralen Abstoßungsreaktion traten alloreaktive CD8 T-Zellen auf. Nur ein Nierentransplantierter Patient wies im ersten Jahr nach seiner Transplantation eine zelluläre Abstoßungsreaktion auf, diese korrelierte mit dem Auftreten einer präformierten zellulären CD8 Alloreaktivität. Im Setting einer Lungentransplantation zeigte einer von vier Patienten eine Abstoßungsreaktion. Dabei handelte es sich um eine zelluläre Abstoßungsreaktion, die wiederum mit einer präformierten CD8 Alloreaktivität korrelierte. Im Kontext einer Schwangerschaft zeigten Schwangere (n=104) nach Geburt ihres Kindes einen Trend zu einer erhöhten CD8 Alloreaktivität gegenüber väterlichen Antigenen. Auch im Rahmen einer longitudinalen Analyse wiesen Schwangere (n=20) nach Geburt ihres Kindes eine erhöhte CD8 Alloreaktivität gegen paternale Antigene im Gegensatz zu Antigenen, die von Third- Party Stimulatoren stammten auf (p=0,0386). Zusammenfassend erlaubt das im Rahmen dieser Arbeit etablierte Verfahren den Nachweis einer präformierten zellulären Alloreaktivität. Im Kontext der Schwangerschaft scheint eine zelluläre Alloreaktivität, die gegen paternale Antigene gerichtet ist, unmittelbar nach Geburt eines Kindes induziert zu werden. Im Kontext der Transplantation hat das Verfahren aufgrund der schnellen Durchführbarkeit innerhalb eines Arbeitstages das Potential zur Identifizierung von Patienten mit einem erhöhten Risiko für eine akute zelluläre Abstoßungsreaktion und könnte zur Steuerung einer individualisierten immunsuppressiven Induktionstherapie bzw. zur Auswahl eines geeigneten Spenders beitragen. Auf Basis der Ergebnisse dieser Arbeit wurde in unserer Abteilung eine deutschlandweite prospektive klinische Multicenter-Studie initiiert, um den prädiktiven Wert alloreaktiver T-Zellen zur Vorhersage von akuten Abstoßungsreaktionen zu evaluieren.

Although preformed alloreactive T-cells can induce acute rejection episodes after organ transplantation, no suitable assays for use in clinical routine are currently available. In this thesis, a new method for the identification of alloreactive T-cells was developed and applied to characterize preformed alloreactivity in 84 renal-, 41 liver- and 36 lung-deficient patients, as well as in 190 healthy controls, and pregnant women. To quantify alloreactivity of a patient against a donor, whole blood of the recipient was stimulated with CD45 pre-stained blood of the donor for 6 h in a mixed lymphocyte reaction. The proportion of alloreactive CD4 and CD8 T-cells was flow-cytometrically determined by intracellular cytokine staining. An autologous stimulation served as negative control, a polyclonal stimulation with Staphylococcus aureus Enterotoxin B (SEB) as positive control. In addition, recipient cells were tested against blood from at least three unrelated third-party stimulators. Moreover, alloreactive T-cells were phenotypically and functionally characterized and the inhibitory effect of immunosuppressive drugs on alloreactive T-cells was evaluated. Alloreactive CD8 T-cells were detected more frequently than alloreactive CD4 T-cells (9.51% vs. 2.66%). Likewise, alloreactive CD8 T-cell-levels were higher than those of CD4 T-cells. Alloreactive T-cells remained detectable for over a time period of one year and were inhibited by immunosuppressive drugs. Alloreactive CD8 T-cells were characterized as effector memory T-cells largely negative for expression of CD27, CD62L, and CCR7. Detection of alloreactive T-cells and alloreactive T-cell levels were associated with higher numbers of HLA mismatches (p=0.0271). Among renal- and lung-deficient patients on the transplant waiting list, a higher proportion had alloreactive T-cells as compared to controls and liverdeficient patients (CD4 T-cells: kidney 4.06%, lung 7.06%, control 1.53%, liver 0.63%; CD8 T-cells: kidney 14.80%, lung 12.94%, control 5.27%, liver 6.88%). Among transplant candidates, 5 out of 84 (5.95%) exhibited alloreactive CD8 T-cells against most third-party stimulators, whereas 26 out of 84 (30.95%) had alloreactive T-cells towards a limited number of stimulators. In contrast, 53 out of 84 did not show any alloreactivity. In the clinical setting of transplantation, three of the 55 kidney transplant recipients showed a humoral rejection. None of the patients with a humoral rejection reaction showed alloreactive CD8 T-cells. Only one kidney transplant patient had a cellular rejection in the first year after transplantation, which correlated with the occurence of preformed cellular CD8 alloreactivity. In the setting of lung transplantation, one out of four patients showed a rejection. This was a cellular rejection reaction, which correlated with preformed CD8 alloreactivity. In the context of pregnancies, pregnant women (n=104) showed a trend towards an increased CD8 alloreactivity to paternal antigens after birth. Likewise, in a longitudinal analysis, pregnant women (n=20) exhibited a higher CD8 alloreactivity against paternal antigens after birth as compared to antigens derived from third-party stimulators (p=0.0386). In summary, the newly established assay allows identification of preformed alloreactive T-cells. In the context of pregnancy, a cellular alloreactivity against paternal antigens appears to be induced immediately after birth. In the context of organ transplantation, the assay to detect cellular alloreactivity within one working day may have potential to identify patients at risk for acute rejection and may be used to guide decisions on individualized immunosuppressive induction therapy or on the choice of an adequate donor. Based on the results of this thesis, our department has initiated a prospective German multicenter study to evaluate the predictive value of preformed alloreactive T-cell of a recipient towards his organ donor for acute cellular rejection episodes.