α2δ3 is the preferred auxiliary α2δ subunit of Cav2.1 channels in spiral ganglion neurons and is required for development of auditory nerve fiber synapses

Abstract

Voltage-gated calcium channels (VGCCs) are composed of a pore-forming α1 subunit and the auxiliary β and α2δ subunits. The largely extracellular α2δ proteins α2δ1-4 modulate the Ca2+ current properties but the reasons for their partial redundancy/specificity are unknown. VGCCs are expressed in a huge variety of tissues, including the auditory system. Acoustically evoked signal processing is carried out in an ultrafast and timely precise way and requires fully functional and developed connections. The cochlea converts mechanical into electrical signals, and transmits these signals via spiral ganglion (SG) neurons to the auditory brainstem. SG neurons are indispensable for a proper hearing function and their loss cannot be compensated by any hearing aid or cochlea implant. The presynaptic Ca2+ channel complex of the mature inner hair cell (IHC) is formed by Cav1.3, ß2 and α2δ2 (Fell et al., 2016). Recently, α2δ subunits have become of interest due to their multiple roles in pain processing, synapse formation and use as therapeutic targets for different drugs. In this work, the role of the α2δ3 subunit of VGCCs was analyzed with respect to (i) its contribution to the ICa in neonatal and mature SG neurons and (ii) the development of the endbulb of Held synapse. Lack of α2δ3 reduced Cav2.1 currents, the dominating Ca2+ channel in cultured SG neurons of mice aged 3-weeks, by 60 %. Furthermore, we found malformed and smaller endbulbs of Held in mice aged 3-weeks. Surprisingly, at P5, when P/Q-type (Cav2.1) channels in SG neurons were not yet expressed, α2δ3 was nevertheless required for a normal endbulb of Held synapse development. This indicates a specific function of α2δ3 in synapse development, which was independent of the presence of the P/Q-type Ca2+ current. The endbulb of Held synapse has been studied not only in the α2δ3 knockout mouse but also in α2δ2 null mutants, to determine how the deletion of α2δ2 affects the development. Analysis of the endbulb of Held synapse showed a decreased VGLUT1-labeled area as well as a decreased number of boutons per bushy cell compared to the wildtype, indicating that also α2δ2 is required for proper endbulb of Held formation at P20. In contrast to IHCs, SG neurons express at least 6 pore-forming subunits and all three neuronal α2δ subunits (α2δ1-3). Taken together, we could show that (i) only Cav2.1 channels mediating P/Q currents were strongly reduced in SG neurons isolated from α2δ3-/- mice at P20, (ii) α2δ3 has a function for synaptic development independent of Cav2.1 channels and (iii) also deletion of α2δ2 affects the development and maturation of the endbulb of Held synapse at P20.

Zusammenfassung Spannungsgesteuerte Kalziumkanäle (VGCCs) bestehen aus einer porenbildenden α1- Untereinheit und den akzessorischen β und α2δ-Untereinheiten. Die weitgehend extrazellulären α2δ Proteine α2δ1-4 modulieren die Eigenschaften von Ca2+-Kanälen, aber die Gründe für ihre partielle Redundanz bzw. Spezifität sind unbekannt. VGCCs werden in einer Vielzahl von Geweben, einschließlich der Cochlea, exprimiert. Die Cochlea ist für die Schalltransduktion und die Übertragung der Informationen zum auditorischen Hirnstamm verantwortlich. Die Aufgabe der Spiralganglien (SG) Neurone ist die Übertragung von Schallinformationen von den Haarzellen der Cochlea zu Neuronen im auditorischem Hirnstamm. SG-Neurone, sind unerlässlich für die Hörfunktion, denn ihr Verlust kann nicht durch ein Hörgerät oder ein Cochlea-Implantat ersetzt werden. Der Ca2+-Kanal-Komplex der ausgereiften Präsynapsen der IHC wird von Cav1.3, β2 und α2δ2 gebildet (Fell et al. 2016). Besonders die α2δ-Untereinheiten sind aufgrund ihrer vielfältigen Funktionen bei der Schmerzverarbeitung, Synapsenbildung und als therapeutische Angriffspunkte für verschiedene Medikamente interessant geworden. In dieser Arbeit wurde die Rolle der α2δ3-Untereinheit von VGCCs im Hinblick auf ihren Beitrag zum Ca2+-Strom von neonatalen und reifen SG-Neuronen und die Entwicklung der Endbulb of Held-Synapse an α2δ3-defizienten Mäusen analysiert. Das Fehlen der α2δ3-Untereinheit reduzierte die Cav2.1-Ströme, welche die dominierenden Ca2+-Ströme von reifen kultivierten SG-Neuronen von 3 Wochen alten Mäusen sind, um 60%. Zudem zeigten α2δ3-defiziente Mäuse im Alter von drei Wochen deformierte und kleinere Endbulb of Held-Synapsen. Überraschenderweise wurde bereits an P5, wenn P/Q (Cav2.1)- Kanäle in SG-Neuronen noch nicht exprimiert werden, α2δ3 für eine normale Bildung von Endbulb of Held-Synapsen benötigt. Dies weist auf eine spezifische Funktion von α2δ3 für die Synapsentwicklung hin, die unabhängig vom P/Q-Ca2+-Strom ist. Die Endbulb of Held-Synapse wurde auch in einer funktionellen α2δ2-null-Mutante untersucht, da diese Mäuse verzerrte auditorische Hirnstammantworten in Welle I zeigten. Ziel war es herauszufinden, wie sich die Deletion von α2δ2 auf die Synapsentwicklung auswirkt. Die Analyse der Endbulb of Held-Synapse zeigte eine verringerte VGLUT1- markierte Fläche der Axonterminale sowie eine geringere Anzahl von Boutons pro Bushy- Zelle im Vergleich zum Wildtyp. Im Gegensatz zu IHCs exprimieren SG-Neurone mindestens 6 porenbildende α1-Untereinheiten und alle drei neuronalen α2δ-Untereinheiten α2δ1, 2 und 3. In dieser Arbeit konnten wir zeigen, dass (i) nur Cav2.1 Kanäle durch das Fehlen der α2δ3 in adulten Mäusen betroffen sind, (ii) α2δ3 eine Funktion in der synpatischen Entwicklung hat, welche unabhängig von Cav2.1 Kanälen ist und (iii) auch das Fehlen von α2δ2 einen Effekt auf die Entwicklung der „Endbulb of Held“ synapse in adulten Mäusen hat.