Rolle von TRPC3 und beta-Untereinheiten spannungsabhängiger Kalziumkanäle in kortikalen Astrozyten

Abstract

Kalzium ist ein wichtiger Botenstoff des Körpers, der an der Regulierung verschiedener Prozesse wie der Proliferation und Migration von Zellen und somit an der Wundheilung beteiligt ist. Der Kalziumhaushalt von Zellen kann über verschiedene Ionenkanäle beeinflusst werden. Zu diesen Ionenkanälen gehören die Transient receptor potential Kanäle (TRP) sowie die spannungsaktivierten Kalziumkanäle (CaVs). In kortikalen Astrozyten konnten bisher die Transkripte von TRPC1, TRPC3 und TRPC4 nachgewiesen werden sowie Transkripte von Untereinheiten spannungsaktivierter Kalziumkanäle. In der vorliegenden Arbeit wurde über eine durch den TRPC4-Agonisten Englerin A (EgA) induzierte Erhöhung der zytoplasmatischen Ca2+-Konzentration die funktionale Expression von TRPC4 in einem Anteil kortikaler Astrozyten festgestellt. Astrozyten mit fehlendem Trpc1 zeigten hierbei einen signifikant erhöhten Ca2+-Einstrom durch EgA, was für eine hemmende Rolle von TRPC1 in heterotetrameren TRPC1/TRPC4 Kanälen spricht. Des Weiteren wurde in der vorliegenden Arbeit eine erhöhte Migrationsrate in kortikalen Astrozyten aus TRPC3 „gain of function“ Moonwalker (MWK) Mäusen nachgewiesen und somit die Annahme verfestigt, dass die Migration mit dem TRPC3-vermittelten Ca2+-Einstrom korreliert. Auch die Proliferation kortikaler Astrozyten scheint von Ca2+-Signalen abhängig zu sein. So zeigten kortikale Astrozyten aus TRPC3-KO Mäusen eine im Vergleich zum Wildtyp (WT) verminderte Proliferation. Ein positiver Effekt auf die Proliferation in vitro durch vermehrten TRPC3 vermittelten Ca2+-Einstrom in Astrozyten aus TRPC1-KO oder MWK Mäusen konnte nicht festgestellt werden. Nach dem Erzeugen einer Wunde in der Großhirnrinde kommt es unter anderem durch Migration und Proliferation von Astrozyten zur Wundheilung. Zusammenfassend konnte so in vitro eine wichtige Rolle von TRPC3 in der durch kortikale Astrozyten vermittelten Wundheilung festgestellt werden. Auch spannungsaktivierte Kalziumkanäle (CaVs) haben ein Einfluss auf den Ca2+-Haushalt von kortikalen Astrozyten. CaVs setzen sich aus der porenbildenden alpha1-Untereinheit sowie aus anderen Untereinheiten wie beta, gama und alpha2delta zusammen. Letztere modulieren die physiologischen Eigenschaften der CaV-Kanäle. Vorversuche ergaben, dass im Gegensatz zu kortikalen Astrozyten aus beta3-defizienten Mäusen, kortikale Astrozyten aus beta2-KO Mäusen einen reduzierten spannungsaktivierten Ca2+-Einstrom aufweisen. In der vorliegenden Arbeit konnte eine verminderte Migration in beta2-defizienten Astrozyten festgestellt werden, während die Proliferation nicht beeinflusst war. Dies weist darauf hin, dass die Migration, nicht aber die Proliferation von dem in beta2-KO kortikalen Astrozyten reduzierten Ca2+-Einstrom abhängig ist. Der in beta2-KO Mäusen reduzierte Ca2+-Einstrom hatte keine Auswirkung auf die Proliferation kortikaler Astrozyten. In beta3-defizienten Astrozyten konnten im Vergleich zum Wildtyp (WT) vermehrte spontane Ca2+-Oszillationen festgestellt werden. In vitro war die Migration der beta3-defizienten Astrozyten reduziert, während in vivo die Astrogliose der Astrozyten vermehrt war. Zusammenfassend konnte in kortikalen Astrozyten gezeigt werden, dass erstens CaVbeta3 eine CaV-unabhängige Funktion aufweist, zweitens CaVbeta2 und CaVbeta3 an der Migration in vitro beteiligt sind und drittens CaVbeta3 in der kortikalen Wundheilung in vivo eine Rolle spielt.

Calcium is an important transmitter which is involved in the regulation of various physiological processes, like proliferation and migration of cells. Thus, calcium is also involved in the process of wound healing. Ion channels like transient receptor potential (TRP) channels and voltage-activated calcium channels (CaVs) can influence the cytoplasmic calcium concentration. Transcripts of TRPC1, TRPC3 and TRPC4 as well as of betasubunits of CaV channels have been detected in cortical astrocytes. In the present work, the TRPC4-agonist Englerin A (EgA) induced an increase in the cytoplasmic Ca2+ concentration in cortical astrocytes, indicating functional expression of TRPC4. In the absence of Trpc1 an augmented EgA-induced cytoplasmic Ca2+ signal was measured, suggesting an inhibitory role of TRPC1 in heterotetrameric TRPC1/TRPC4 channels. Furthermore, the present study revealed an increased migration of cortical astrocytes isolated from “TRPC3 gain of function” moonwalker (MWK) mice as compared to astrocytes isolated from the cortex of wild type (WT) mice. This supports the theory that TRPC3 induced Ca2+ entry contributes to the migration of cortical astrocytes. Proliferation of cortical astrocytes is also linked to TRPC3-mediated Ca2+-signals. In the present study, cortical astrocytes of TRPC3-deficient mice showed less proliferation as compared to WT astrocytes. However, an increased TRPC3-dependent cytoplasmic Ca2+-entry, as described for TRPC1-deficient or MWK astrocytes, did not seem to increase astrocyte proliferation. After a brain injury, proliferation and migration of astrocytes play a major role in the processes of wound healing. Thus, in summary, the present study in vitro suggests, that TRPC3 plays an essential role in the wound healing process mediated by cortical astrocytes. Voltage-activated calcium channels have also been described to impact cytoplasmic Ca2+ levels in cortical astrocytes. CaVs are composed of a pore-forming alpha1-unit and the auxiliary subunits beta, gamma dan alpha2delta which are known to modify physiological characteristics of CaVchannels. In previous experiments, cortical astrocytes with CaVbeta2-deficiency showed a reduction of voltage-activated Ca2+ entry, while Ca2+ entry was not altered in cortical astrocytes with beta3-deficiency. In the present study, absence of beta2 lead to less migration of cultured cortical astrocytes as compared to astrocytes isolated from WT mice. However, no difference between beta2-deficient and WT astrocytes was detected in proliferation. This suggests, that migration but not proliferation might dependent on Ca2+ entry of cortical astrocytes with contribution of beta2. Beta3- deficient astrocytes revealed increased spontaneous Ca2+ oscillations as compared to WT astrocytes. It could be shown that migration of CaVbeta3-deficient cortical astrocytes in vitro is reduced while astrogliosis in vivo is enhanced. In conclusion, the results regarding cortical astrocytes show firstly, that CaVbeta3 possess a CaV-independent function in Ca2+ signaling, secondly, that CaVbeta2 und CaVbeta3 have an influence on migration in vitro and thirdly, that CaVbeta3 plays a role in the cortical wound healing process in vivo.