The effect of antiamoebic agents on human corneal cells and the Acanthamoeba castellanii 1BU strain

Abstract

Background: Acanthamoeba keratitis is a progressive, sight-threatening disease. The correct diagnosis is often delayed for the patients. In an early stage, ophthalmologists observe pseudodendritiformic epitheliopathy, “dirty epithelium”, spot-like multifocal stromal infiltrates and radial perineuritis. Later on, a ring infiltrate develops and in long-standing, recalcitrant Acanthamoeba keratitis, uveitis, retinal vasculitis and scleritis may occur and result in blindness. Since AK presents with heterogeneous clinical appearance and low incidence, there have been no clinical trials comparing different treatment modalities in this disease and no standardized treatment of AK has been established, yet. The lack of a standardized therapy against AK is also in part due to the lack of a generally agreed drug testing regime against Acanthamoeba. Therefore, we had the following purposes:  Histological analysis of two Acanthamoeba keratitis eyes with anterior and posterior segment inflammation and blindness.  To analyze the effect of biguanides (polyhexamethylen biguanid (PHMB), chlorhexidine (CH)) and diamidines (hexamidine-diisethionat (HD), propamidin-isethionate (PD), dibromopropamidine-diisethionat (DD)) on human corneal epithelial cell, keratocyte and endothelial cell viability, proliferation and migration, in vitro.  To compare LDH release assay, trypan blue and fluorescent stainings and non-nutrient Escherichia coli (E. coli) plate assay in determining treatment efficacy of antiamoebic-agents against Acanthamoeba castellanii trophozoites and cysts, in-vitro.  To analyze the concentration dependent effect of biguanides (PHMB, CH); diamidines (HD, PD, DD); natamycin (NM); miltefosine (MF); povidone iodine (PVPI) and chlorin e6 photodynamic therapy (PDT) on Acanthamoeba castellanii trophozoites and cysts, in vitro.

Methods: • Two eyes of 2 patients (age 45 and 51 years) with Acanthamoeba keratitis (PCR of epithelial abrasion positive) were analysed. Patients underwent triple-topical therapy (polyhexamethilen-biguanide, propamidin-isethionat and neomycin) and with failed recovery, subsequent crosslinking, corneal cryotherapy, repeat penetrating keratoplasties, amniotic membrane transplantations and phacoemulsification with posterior chamber lens implantation. The patients developed ocular hypotony with central vein/artery occlusion and retinal/choroidal detachment and had no light perception; therefore, the inflamed eyes were enucleated. Histological analysis was performed using haematoxilin-eosin, periodic acid- Schiff and Gömöri-methenamine silver staining. • For epithelial and endothelial cells a human cell line, and for keratocytes primary cultures were used (n=6 each). We used 7.8x10-5-0.02% PHMB or CH, 3.9x10-4-0.1% HD, PD or DD, 3.9x10-4-0.0125% PD concentration for 24 hours to determine viability (Cell Proliferation Kit XTT), proliferation (Cell Proliferation ELISA BrdU kit) and migration using wound healing assay. Viability/proliferation/migration values of each drug were summarized as “area under curve” (AUC) together with a Mann-Whitney test. • Acanthamoeba castellanii strain 1BU-trophozoites/cysts were challenged with the antiamoebic-agents 0.02% PHMB, 0.1% PD and 0.0065% MF. Efficacies of the drugs were determined by LDH-release and trypan blue assays. The fluorescent dyes Hoechst 33343, calcein-AM, and ethidium-homodimer-1 were tested for their abilities to differentiate between viable and dead 1BU-trophozoites/cysts following treatment, a non-nutrient agar Eshericia coli (E. coli) plate assay was applied to monitor the outgrowth of 1BU-trophozoites/cysts challenged with antiamoebic-agents. • Acanthamoeba castellanii 1BU strain was cultured in 712 peptone-yeast extract-glucose (PYG) medium. Thereafter, trophozoites or cysts were cultured in 0,005-0.02% PHMB, CH or 0.25-0.1% HD, PD, DD, or 5% NM or 0.001625-0.0065% MF or 0.25-1% PVPI containing PYG medium for 2 hours or underwent Chlorin e6-PDT. Then, the percentage of dead trophozoites was determined by CytoTox 96® Non-Radioactive Cytotoxicity assay and trypan blue staining and those of cysts using trypan blue staining. Treated cysts were also inoculated on non-nutrient agar E. coli plates and were observed for 5 weeks.

Results: • We could not observe Acanthamoeba trophozoites or cysts neither in the cornea nor in other ocular tissues in the enucleated eyes. There were anterior synechiae in the chamber angle of both globes and lymphocytic infiltration around central retinal artery and vein, associated with fibrous metaplasia of the retinal pigment epithelium. We saw perivascular inflammatory cell infiltration (mainly lymphocytes) in the episclera and around ciliary nerves, analysing the first globe. This was associated with non-granulomatous uveitis, cilioschisis and tractional retinal detachment. Cross sections of the optic nerve revealed gliosis and optic nerve atrophy. Histopathologic studies of the second globe revealed a multifocal, non-granulomatous choroiditis with lymphocytic infiltration. • HCEC, keratocyte and HCEC-12 viability AUC, comparing PD and PHMB (p≤0.014 for all; PD better) or PD and HD (p≤0.011 for all; PD better) differed significantly. Keratocyte and HCEC-12 viability AUC comparing CH and HD (p≤0.027; CH better), HCEC-12 viability AUC comparing PD and HD (p=0.005; PD better) and HCEC viability AUC comparing CH and PHMB (p=0.014; CH better) differed significantly. HCEC proliferation AUC, comparing PD with PHMB, CH, DD, HD (p≤0.016; PD worse for all) and keratocyte proliferation AUC, comparing PHMB with HD, PD (p=0.004; p=0.002; PHMB better for both), CH with HD, PD (p≤0.001; CH better for both) and DD with PD (p=0.043; DD better) differed significantly. Keratocyte migration AUC comparing PD with control, PHMB, CH, DD and HD differed significantly (p≤0.012; PD worse for all). • All three antiamoebic-agents induced a significant LDH-release from trophozoites, when compared to controls (p<0.0001). There was a negligible fluorescent-dye staining in untreated 1BU-throphozoites/cysts, but after challenging with antiamoebic-agents, there was 59.3-100% trypan blue, 100% Hoechst 33342, 0-75.3% calcein-AM and 100% ethidium-homodimer-1 positivity. On non-nutrient agar E. coli plates, in controls and MF treated 1BU trophozoites/cysts, new trophozoites appeared within 24 hours, and encystment occured after 5 weeks. In PHMB and PD treated 1BU-throphozoites/cysts, irregularly shaped, smaller trophozoites appeared after 72 hours, which failed to form new cysts within 5 weeks. • All concentrations of different antiamoebic agents had a significant cytotoxic effect on AK trophozoites and cysts (p<0.05), except 0.02% PHMB or CH, for trophozoites, and 0.005% CH or Ce6-PDT for cysts, using trypan blue assay. On agar plates, normal shaped trophozoites could not be observed using PHMB, CH, HD, PD, NM and PVPI treatment and cysts could not be formed again within 5 weeks. DD and MF treated cysts could excyst and after one week encyst again.

Conclusions:  In long-standing, recalcitrant Acanthamoeba keratitis, uveititis, retinal vasculitis and scleritis may occur and result in blindness, even without further persistence of Acanthamoeba trophozoites or cysts. In this stage of Acanthamoeba keratitis, systemic immune suppression may be necessary for a longer time period.  Chlorhexidin as biguanide and propamidin-isethionate as diamidine may be used clinically to reduce cytotoxicity of antiamoebic treatment on human corneal cells. Diamidines reduce proliferation of human epithelial cells and keratocytes more than biguanides and propamidin-isethionate reduces migration of keratocytes. Therefore, in spite of lower cytotoxicity, the inhibitory effect on proliferation and migration indicates that extended use of propamidin-isethionate should be avoided in patients.  None of the enzymatic- and dye-based viability assays tested here generated survival rates for trophozoites/cysts that were comparable with those yielded with the non-nutrient agar E. coli plate assay, suggesting that the culture-based assay is the best method to study the treatment efficacy of drugs against Acanthamoeba.  PHMB, CH, HD, PD, NM and PVPI seem to be more effective against Acanthamoeba castellani 1BU strain, than DD and MF. In vitro analysis of treatment efficacy of different antiamoebic agents, especially the non-nutrient agar Eschericia coli plate assay may provide information on specific treatment of different Acanthamoeba strains in the future.

Hintergrund: Die Akanthamöben-Keratitis (AK) ist eine progressive, potentiell blindmachende Erkrankung. Die richtige Diagnose wird bei den Patienten oft erst verzögert gestellt. In einem frühen Stadium beobachten Augenärzte pseudodendritiforme Epitheliopathie, "schmutziges Epithel", punktförmige multifokale stromale Infiltrate und eine radiale Perineuritis. Später entwickelt sich ein Ringinfiltrat und bei langjähriger, hartnäckiger Akanthamöben-Keratitis, kann es zur Uveitis, retinale Vaskulitis und Skleritis und sogar zur Erblindung kommen. Da AK in der Regel mit einem heterogenem klinischen Erscheinungsbild und geringer Inzidenz auftritt, gab es keine klinischen Studien, die verschiedene Behandlungsmodalitäten bei dieser Krankheit verglichen hätten. Es wurde daher noch keine standardisierte Behandlung der AK etabliert. Das Fehlen einer standardisierten Therapie gegen die AK ist auch zum Teil auf das Fehlen einer allgemeinen Richtlinie zur Therapie einer Akanthamöben Infektion zurückzuführen. Ausgehend davon hatten wir folgende Ziele für diese Arbeit: - Histologische Analyse von zwei Akanthamöben-Keratitis-Augen mit Entzündungen im vorderen und hinteren Segment und Erblindung. - Es sollte die Wirkung von Biguaniden (Polyhexamethylenbiguanid (PHMB), Chlorhexidin (CH)) und Diamidinen (Hexamidin-Diisethionat (HD), Propamidin-Isethionat (PD), Dibromopropamidin-Diisethionat (DD)) auf die Viabilität, Proliferation und Migration von humanen kornealen Epithelzellen, Keratozyten und Endothelzellen in vitro analysiert werden. - Der Vergleich von LDH-Freisetzungstests, Trypanblau- und Fluoreszenzfärbungen und nährstofffreien-Escherichia coli (E. coli)-Platten-Tests zur Bestimmung der Effektivität von Anti-Amöbika gegen Akanthamöben castellanii Trophozoiten und Zysten in vitro. - Es sollte die konzentrationsabhängige Wirkung von Biguaniden (PHMB, CH), Diamidinen (HD, PD, DD), NM, MF, PVPI und Chlorin e6 Photodynamische Therapie (PDT) bei Akanthamöben castellani Trophozoiten und Zysten in vitro analysiert werden. Methoden: - Zwei Augen von 2 Patienten (Alter 45 und 51 Jahren) mit Akanthamöben-Keratitis (Diagnose erfolgte durch PCR des epithelialen Abrasions positiv) wurden analysiert. Die Patienten wurden einer dreifach topischen Therapie (Polyhexamethilen-biguanid, Propamidin-Isethionat und Neomycin) und aufgrund fehlenden Therapieerfolges mit anschließendem Crosslinking, Hornhaut-Kryotherapie, wiederholten perforierenden Keratoplastiken, Amnionmembrantransplantationen und Phakoemulsifikation mit Kunstlinsenimplantation der hinteren Kammer unterzogen. Die Patienten entwickelten eine okuläre Hypotonie mit zentraler Venen/Arterien-Verschluss- und Netzhaut-Aderhautablösung und hatten keine Lichtwahrnehmung; daher wurden die entzündeten Augen enukleiert. Die histologische Analyse wurde mit Hämatoxilin-Eosin, Periodsäure-Schiff und Gömöri-Methenamin-Silberfärbung durchgeführt. - Für die Zellkulturversuche wurde jeweils eine humane Epithelzell (HCEC)- und Endothelzelllinie (HCEC-12) und eine Keratozyten Primärkultur (n=6) verwendet. Wir verwendeten 7,8 x 10-5 - 0,02% PHMB oder CH, 3,9 x 10-4 - 0,1% HD, PD oder DD, 3,9 x 10-4 - 0,0125% PD-Konzentration für 24 Stunden, um die Viabilität (Cell Proliferation Kit XTT), die Proliferation (Cell Proliferation ELISA BrdU Kit) und die Migration mittels Wundheilungstest zu bestimmen. Die Ergebnisse der Viabilitäts-, Proliferations- und Migrationswerte wurden zusammen mit einem Mann-Whitney-Test berechnet und als "area under curve" (AUC) dargestellt. - Der Akanthamöben castellanii Stamm 1BU (Trophozoiten und Zysten) wurde mit den Antiamöbika 0,02% Polyhexamethylen-biguanid (PHMB), 0,1% Propamidin-isethionat (PD) und 0,0065% Miltefosin (MF) inkubiert. Die Wirksamkeit der Medikamente wurde durch die LDH-Freisetzung und den Trypanblau-Assay bestimmt. Die Fluoreszenzfarbstoffe Hoechst 33343, Calcein-AM und Ethidium-Homodimer-1 wurden verwendet, um nach der Behandlung zwischen lebensfähigen und toten 1BU-Trophozoiten/Zysten zu unterscheiden. Ein nährstofffreier Agar-Eschericia coli (E. coli)-Plattentest wurde angewendet, um das Wachstum von 1BU-Trophozoiten und Zysten zu beurteilen, die mit den Anti-Acanhtamoeben-Medikamenten behandelt wurden. - Die Anzucht des Akanthamöben castellani 1BU Stamm erfolgte in 712 Pepton-Hefeextrakt-Glukose (PYG) Medium. Anschließend wurden Trophozoiten oder Zysten in 0,005-0,02% PHMB, CH oder 0,25-0,1% HD, PD, DD oder 5% NM oder 0,001625-0,0065% MF oder 0,25-1% PVPI enthaltendes PYG-Medium für 2 Stunden inkubiert oder einer Chlorin e6-PDT unterzogen. Anschließend wurde der Anteil der toten Trophozoiten durch den CytoTox 96® Non-Radioactive Cytotoxicity Assay und die Trypanblau-Färbung bestimmt, der Anteil der toten Zysten nur durch die Trypanblau-Färbung. Die behandelten Zysten wurden zusätzlich auf nährstofffreie Agar E. coli-Platten geimpft und 5 Wochen lang beobachtet. Ergebnisse: - Akanthamöben Trophozoiten oder Zysten konnten wir weder in der Hornhaut noch in anderen Augengeweben in den enukleierten Augen beobachten. Es gab anteriore Synechien im Kammerwinkel der beiden Augen und lymphozytäre Infiltration um die zentrale Netzhautarterie und Vene, verbunden mit fibröser Metaplasie des retinalen Pigmentepithels. Wir sahen eine perivaskuläre Infiltration inflammatorischer Zellen (hauptsächlich Lymphozyten) in der Episklera und um die Ziliarnerven herum. Die Analyse des ersten Auges zeigte eine nicht-granulomatöse Uveitis, Cilioschisis und traktive Netzhautablösung. Querschnitte des Sehnervs zeigten eine Gliose und eine Sehnervenatrophie. Die histopathologische Untersuchungen des zweiten Auges zeigten eine multifokale, nicht-granulomatöse Choroiditis mit lymphozytärer Infiltration. - AUC der Viabilitätsassays von HCEC, Keratozyten und HCEC-12 unterschied sich signifikant im Vergleich von PD gegen PHMB (p≤0.014 für alle; PD besser) und im Vergleich von PD und HD (p≤0.011 für alle; PD besser). Die AUC des Viabilitätsassay unterschied sich signifikant bei Keratozyten und HCEC-12 im Vergleich von CH und HD (p≤0.027; CH besser), bei HCEC-12 im Vergleich von PD und HD (p=0.005; PD besser), und bei HCEC im Vergleich von CH und PHMB (p=0.014; CH besser). Bei den Proliferationstesten zeigte die AUC bei den HCEC im Vergleich von PD gegen PHMB, CH, DD und HD signifikante Unterschiede (p≤0.016; PD schlechter für alle). Die Ergebnisse der Proliferationsteste bei den Keratozyten zeigten Unterschiede bei der AUC im Verglich von PHMB mit HD und PD (p=0.004; p=0.002; PHMB besser für beide), CH mit HD und PD (p≤0.001; CH besser für beide), und im Vergleich von DD mit PD (p=0.043; DD besser). Bei den Migrationstesten zeigten sich signifikante Unterschiede bei den Keratozyten im Vergleich von PD mit der Kontrolle, PHMB, CH DD und HD (p≤0.012; PD schlechter für alle). - Alle drei Anti-Amöbika induzierten im Vergleich zur Kontrolle eine signifikante LDH-Freisetzung bei den Trophozoiten (p<0,0001). Es gab eine vernachlässigbare Fluoreszenzfärbung bei unbehandelten 1BU-Throphozoiten/Zysten, aber nach der Inkubation mit den Anti-Amöbika zeigten sich in der Trypanblau Färbung 59,3-100%, nach der Inkubation mit Hoechst 33342 100%, bei Calcein-AM 0-75,3% und bei Ethidium-Homodimer-1 100% positive Zellen. Auf nährstofffreien Agar-E. coli-Platten, traten bei der Kontrolle und den MF-behandelten 1BU-Trophozoiten/Zysten innerhalb von 24 Stunden neue Trophozoiten auf, nach 5 Wochen bildeten sich erneut Zysten. Bei den mit PHMB und PD behandelten 1BU-Throphozoiten/Zysten traten nach 72 Stunden unregelmäßig geformte, kleinere Trophozoiten auf, die innerhalb von 5 Wochen keine neuen Zysten bildeten. - Bei allen Konzentrationen der verschiedenen amöbenhemmenden Mitteln zeigte sich eine signifikante zytotoxische Wirkung auf Akanthamöben Trophozoiten und Zysten (p<0,05), mit Ausnahme von 0,02% PHMB oder CH bei Trophozoiten und 0,005% CH oder Ce6-PDT bei Zysten unter Verwendung des Trypanblau-Tests. PHMB, CH, HD, PD, NM und PVPI Furhten zu morphologischen Veranderungen der Akanthamöben-Trophozoiten, die innerhalb von 5 Wochen keine Zysten mehr bilden Konnten. Die mit DD und MF behandelten Zysten konnten exzystisch und innerhalb von eine Woche wieder enzystisch werden. Schlussfolgerungen: - Bei langjähriger, andauernder Akanthamöben-Keratitis können Uveititis, retinale Vaskulitis und Skleritis auftreten und zur Erblindung führen, auch ohne weitere Persistenz von Akanthamöben-Trophozoiten oder Zysten. In diesem Stadium der Akanthamöben-Keratitis kann eine systemische Immunsuppression über einen längeren Zeitraum notwendig sein. - Chlorhexidin als Biguanid und Propamidin-Isethionat als Diamidin können klinisch eingesetzt werden, um die Zytotoxizität der antiamöbischen Behandlung an humanen Hornhautzellen zu reduzieren. Diamidine reduzieren die Proliferation von humanen Epithelzellen und Keratozyten mehr als Biguanide. Propamidin-Isethionat senkt die Migrationaktivität von Keratozyten. Daher deutet die hemmende Wirkung auf Proliferation und Migration trotz geringerer Zytotoxizität darauf hin, dass eine längere Verwendung von Propamidin-Isethionat bei Patienten vermieden werden sollte. - Da die enzymatischen und farbstoffbasierten Vitalitätsteste stark unterschiedliche Ergebnisse für Trophozoiten/Zysten aufwiesen, die mit denen des nährstofffreien Agar E. coli-Platten-Assays nicht vergleichbar waren, deutet es daraufhin, dass der kulturbasierte Assay die beste Methode ist, um die Behandlungseffektivität von Medikamenten gegen Akanthamöben zu untersuchen. - PHMB, CH, HD, PD, NM und PVPI scheinen effektiver gegen den Akanthamöben castellani 1BU Stamm zu sein, als DD und MF. In vitro-Analysen, insbesondere die Analyse mit nährstofffreien Agars Eschericia coli Plattenassays können uns Informationen über die Wirksamkeit der verschiedenen amöbenhemmenden Mittel bei verschiedenen Akanthamöben-Stämmen liefern.