Genotypische und phänotypische Analyse komplexer Mutationsmuster innerhalb der NS3-Protease des Hepatitis C Virus unter Erst- und Re-Therapie mit Proteaseinhibitoren

Abstract

Einleitung: Nach Schätzungen der WHO sind derzeit mind. 70 Mio. Menschen der Weltbevölkerung mit dem Hepatitis C Virus (HCV) infiziert. Eine Chronifizierung der Erkrankung kann eine progredient verlaufende Schädigung der Leber begünstigen und über fibrotische und zirrhotische Veränderungen der Leber zur Entstehung des hepatozellulären Karzinoms führen. Mit der langjährigen Standardtherapie aus Interferon und Ribavirin konnten jedoch nur 40 bis 50 % der Patienten, die an chronischer Hepatitis C mit dem Genotyp 1 erkrankt waren, geheilt werden. Klinische Studien mit direkt antiviral wirkenden Substanzen, die spezifisch gegen Proteine des Hepatitis C Virus gerichtet sind, erwiesen sich gegenüber der Therapie aus Interferon und Ribavirin als überlegen. Mit der Zulassung der Proteaseinhibitoren der ersten Generation im Jahr 2011, Boceprevir und Telaprevir, war es nun möglich, 70 bis 80 % der Patienten mit einer Genotyp 1 Infektion erfolgreich zu therapieren. Limitierend für den Therapieerfolg mit direkt antiviralen Medikamenten ist die Selektion resistenter Virusvarianten, was mit einem Therapieversagen assoziiert ist. In den Zulassungsstudien von Boceprevir und Telaprevir konnten in bis zu 77 % der nicht erfolgreich therapierten Patienten bekannte Resistenzen an wichtigen Positionen innerhalb der NS3 Protease (v.a. V36, T54, V55, R155, A156 und V170) nachgewiesen werden. Somit ist nicht jeder Wirkungsverlust des Proteaseinhibitors mit dem Nachweis bekannter Resistenzmutationen zu erklären. Weitere Virusvarianten unter Therapie mit einem Proteaseinhibitor könnten auf die Resistenzentwicklung Einfluss nehmen. Durch die Verfügbarkeit von immer mehr direkt antiviral wirkenden Medikamenten steigt auch die Wahrscheinlichkeit, dass Patienten nach einem ersten Nichtansprechen mit einem weiteren direkt antiviralen Medikament re-therapiert werden. Ob initial selektionierte Resistenzvarianten hierbei re-selektioniert werden und somit eventuell Einfluss auf das weitere Therapieansprechen haben, sollte durch die Analyse von Patienten, nach Re-Therapie mit Boceprevir, geklärt werden. Methoden: HCV Genotyp 1 infizierte Patienten (n=37) wurden im Rahmen von zwei Phase 1b Studien für jeweils zwei Wochen mit einer Boceprevir (n=22) bzw. Telaprevir (n=15) Monotherapie behandelt. Alle diese Patienten gingen als Non-Responder aus den Therapien hervor, weshalb eine klonale Sequenzanalyse des HCV NS3 Protease Gens direkt vor und nach der Therapie, sowie zwei Wochen nach Beendigung der Therapie durchgeführt wurde. Die Sequenzen vor Therapie der Boceprevir-behandelten Patienten wurden per Direktsequenzierung erhalten und dienten als Vergleichssequenzen bei der Auswertung der klonalen Daten. Um neue, noch nicht beschriebene Mutationsmuster, welche mit dem Versagen auf eine direkt antivirale Therapie assoziiert sind, zu identifizieren, wurde ein multivariater Apriori Pattern Mining Ansatz angewendet, welcher Variationen in den Sequenzdaten extrahiert, die wiederholt gleichzeitig auftreten. Für jedes dieser gleichzeitig auftretenden Mutationsmuster wurde berechnet, wie groß die Veränderung der Quasispezies auf Nukleotidebene im Vergleich zu den vor Therapie, nach Therapie und Verlaufszeitpunkten ist. Die so identifizierten potentiellen neuen Resistenzvarianten wurden zur phänotypischen Charakterisierung in das Con1b-Replikon eingebaut. Über die Bestimmung des IC50-Wertes für jede Mutation sowie den Wildtyp wurde das Resistenzniveau der neuen Mutationen gegenüber Boceprevir und Telaprevir, sowie den makrozyklischen HCV NS3 Proteaseinhibitoren Danoprevir, Faldaprevir und Simeprevir ermittelt. Zur Analyse der möglichen Re-Selektion resistenter Varianten wurde eine klonale Sequenzanalyse des HCV NS3 Protease Gens bei neun HCV Genotyp 1 infizierten Non-Responder Patienten nach sequentieller Therapie mit Boceprevir durchgeführt. Ergebnisse: In der klonalen Sequenzanalyse konnten am Ende der zweiwöchigen Therapie mit Boceprevir bzw. Telaprevir als Monotherapie eine Vielzahl von Varianten mit einer Häufigkeit von ≥ 5% innerhalb der Quasispezies nachgewiesen werden. Die Anwendung der multivariaten Apriori Pattern Mining Methode konnte die Anzahl der relevanten Varianten deutlich reduzieren. Neben Virus Varianten an sechs Positionen (V36, T54, V55, R155, A156, V170) mit bereits beschriebener Resistenz gegenüber Proteaseinhibitoren, sowie drei Varianten mit bereits ausgeschlossener Resistenzwirkung (V48I, T72I, I153V) wurden vier weitere Varianten an den Positionen A87, R117, V132 und S174 von bisher unbekannter klinischer Bedeutung identifiziert. Für die Variante V132A konnte kein erhöhtes Resistenzniveau nachgewiesen werden. Die weiteren Varianten hingegen führten zu einer niedrigen bis mittleren Resistenzentwicklung gegenüber Boceprevir (A87T), Telaprevir (R117H und S174F) und Simeprevir (S174F) in vitro. Die Analyse zur Re-Selektion resistenter Varianten nach sequentieller Therapie mit Boceprevir lieferte ein sehr heterogenes Ergebnis. Bei fünf Patienten fand sich ein unterschiedliches Mutationsmuster nach der ersten und zweiten Behandlung. Bei drei Patienten zeigten sich identische Varianten nach beiden Therapiezyklen und ein Patient wies bereits vor beiden Therapien eine resistente Variante (V55A) zu 100% in der Quasispezies auf, welche auch im weiteren Verlauf die dominante Variante an dieser Position blieb. Fazit: Neben den bekannten Resistenzmutationen führten weitere neu identifizierte minore Varianten zu einem Wirkungsverlust einer Therapie gegenüber drei der bisher zugelassenen HCV NS3 Proteaseinhibitoren. Das Spektrum an Resistenzmutationen war somit komplexer als bisher bekannt. Ein direkter Hinweis auf eine rasche Re-Selektion resistenter Varianten nach wiederholter direkt antiviraler Therapie konnte nicht gezeigt werden.

Introduction: According to estimates of the World Health Organization more than 70 million people worldwide are infected with hepatitis C virus at present. A chronic course of the disease can promote progressive harm to the liver and lead to fibrotic and cirrhotic changes of the liver parenchyma. Long-standing chronic disease may also contribute to the emergence of a hepatocellular carcinoma. With former standard of care consisting of interferon and ribavirin only 40 to 50 % of patients suffering from a chronic hepatitis C genotype 1 infection could be treated successfully. In clinical trials direct acting antiviral agents targeting hepatitis C virus related proteins were proved to be superior to the combination of interferon and ribavirin alone. With the approval of first generation protease inhibitors boceprevir and telaprevir in 2011 the sustained virologic response rate in hepatitis C genotype 1 infected patients increased significantly up to 70 to 80 %. However, the emergence of drug-resistant variants is a limiting factor for a successful therapy with direct acting antiviral agents. In boceprevir and telaprevir phase III clinical trials already well described resistance associated variants within NS3 protease sequence (especially at positions V36, T54, V55, R155, A156, and V170) could be identified in up to 77 % of therapy failure. Therefore not every therapy failure can be explained by the emergence of these variants alone. It can be assumed that further resistance-associated variants not identified so far emerge during therapy with a protease inhibitor. As an increasing number of direct acting antiviral agents (DAA) are available on the market, the likelihood increases to retreat non-responder patients with a further specifically targeted antiviral therapy. The impact of resistance associated variants on treatment response to a second regime with a direct antiviral agent needs to be determined. Therefore patients were treated sequentially with the protease inhibitor boceprevir and a clonal analysis was performed. Methods: HCV genotype 1 infected patients (n=37) were treated in two phase 1b studies with boceprevir (n=22) or telaprevir (n=15) as a monotherapy for 14 days. All patients were non-responders to the protease inhibitor based therapy. Clonal sequence analysis of the HCV NS3 protease gene was performed before therapy, at the end of therapy and two weeks after the end of therapy. In the boceprevir group however, the consensus sequence for each patient was generated by population sequencing and used as a reference sequence for further genotypic analysis. To identify new mutational patterns associated with DAA therapy failure and not described so far, a multivariate a priori pattern mining approach was applied. This sequence analysis aimed at extracting mutation pattern which appear concurrently and repeatedly within the sequence data. For each of these co-occurring variations the mutational shift of the quasispecies away from the baseline was calculated before starting therapy and at post-therapy time points. New resistance variant candidates were tested in the con1b replicon system for phenotypic characterization. Resistance level was calculated by IC50 determination for each variant and wildtype for boceprevir and telaprevir in the replicon system. In the same way resistance levels were also calculated for the macrocyclic HCV NS3 protease inhibitors danoprevir, faldaprevir and the meanwhile approved antiviral agent simeprevir. Nine HCV genotype 1 infected patients, non-responders to former standard of care, were treated sequentially with boceprevir. To identify possible re-selection of resistant variants, clonal sequence analysis of HCV NS3 protease gene was performed. Results: At the end of two weeks therapy with boceprevir or telaprevir as monotherapy many variants with ≥ 5 % frequency within quasispecies could be detected by clonal analysis. Application of a multivariate a priori pattern mining approach could reduce the number of possible resistance candidates. Already well described therapy associated mutations with increased resistance level against either protease inhibitor at six positions (V36, T54, V55, R155, A156, V170) and three known variants (V48I, T72I, I153V) conferring no resistance could be identified. Remaining variants at positions A87, R117, V132 and S174 appeared as variants with unknown clinical significance so far. While for the V132A variant no increased resistance level could be demonstrated, remaining variant candidates confer a low to medium level of resistance for boceprevir (A87T), telaprevir (R117H and S174F) and simeprevir (S174F). Study data after sequential therapy with boceprevir yielded heterogenous results. The spectrum of resistance variants after the first and second therapy was different in five patients and within three patients resistance mutations were re-selected during the second therapy. One patient had the V55A variant in 100 % of sequences within quasispecies at pretreatment time point and remained the dominant variant during therapy. Conclusion: In addition to the already known resistance mutations minor variants could be identified which contribute to loss of antiviral efficacy during treatment with three of the HCV NS3 protease inhibitors approved for therapy so far. The extent of resistance mutations is much more complex than expected so far. In the present study investigating a sequential direct antiviral therapy with the same protease inhibitor, results were inconclusive and no evidence for rapid re-selection of resistant variants could be demonstrated.