Etablierung einer Kollagenase-freien Methode zur Untersuchung regulatorischer T-Zellen in Tumorfrischgewebe des Nierenzellkarzinoms

Abstract

Renal cell carcinoma is a malignant tumor with a steadily increasing incidence rate in adult-hood. The malignancy potential differs depending on the histology, however, surgical treatment is currently the only curative approach. At the time of diagnosis, 20-30 % of RCC have already metastasized and as part of the follow-up after nephrectomy, metastases occur within 36 to 48 months in 13-30 % of the cases, depending on the primary stage. In these cases, a systemic therapy is recommended. However, increased ABC transporter expression in the carcinoma cells (in particular of p-glycoprotein) can lead to a natural resistance of the tumor cells to conventional chemotherapeutic agents. Therapy of metastatic renal cell carcinoma therefore takes place as part of systemic therapy using multi-kinase inhibitors, cytokines, mTOR inhibitors and checkpoint inhibitors. Against the background of heterogenous response to immunotherapy, the immunomodulatory activity of the regulatory T cells (Treg) is the subject of research. Of particular interest regarding the modulation of anti-tumor defense is the endogenous immunosuppression by Treg cells. For this purpose, an efficient isolation method of tumor-infiltrating lymphocytes (TIL) from fresh tumor tissue with high vital cell yield and a sufficient amount of intact TIL is indispensable. Up to now, tissue digestion protocols based on collagenase have been used as the standard method for TIL isolation for subsequent further cell analysis. Collagenase is a naturally oc-curring peptidase in humans and exists in different subtypes. Due to the high vital cell yield, this method has long been considered the method of choice. However, the proteolytic nature of collagenase is known to result in modifications of membrane-bound receptors and other surface molecules on the T cells. The latter proves to be problematic since intact cell structures and surface protein profiles are an indispensable prerequisite for high-resolution flow cytometric measurements or functional in vitro cell culture assays. In order to analyze the Treg cell populations in the kidney tumor tissue more accurately by means of immunofluorescence methods, we first used the standard collagenase method to produce a single cell suspension according to established protocols. We found that the collagenase-based enzymatic tissue digestion protocol had a significantly negative effect on the fluorescence intensity of different surface markers. This led to a distortion of the flow cytometry results. In contrast, a collagenase-free protocol allowed more detailed and accurate analysis of T cells and Treg cells. A combined enzymatic-mechanical, as well as a purely mechanical method (MiniLys ©) were therefore investigated. The purely mechanical tissue dissociation was found to be equivalent to the standard protocol in terms of cell yield. Moreover, the cell yield was significantly higher in tumors of hard consistency than the purely enzymatically processed samples. Furthermore, the MiniLys © protocol is not only less time-consuming, but also requires a smaller amount of tumor material. This efficiency of the isolation method is particularly relevant with regard to the stage distribution in RCC diagnosis, as an estimated 65 % are being operated at the locally limited stage of the disease (Howlader N 2018). The present thesis shows that the purely mechanical method represents a possible alternative to the enzymatic digestion and that it can be significantly superior with respect to efficiency and accuracy. As a result, the "Mini-Lys" © protocol "a-20 sec" could be established as a new standard operation procedure (SOP) for the future production of single cell suspension from fresh kidney tumor tissue.

Das Nierenzellkarzinom (NZK) ist ein maligner Tumor mit stetig steigender Inzidenzrate im Erwachsenenalter. Das Malignitätspotential differiert je nach Histologie, jedoch gilt in allen Fällen die operative Therapie als der einzige kurative Ansatz. Zum Zeitpunkt der Diagnosestellung liegt in 20-30 % der Fälle bereits ein metastasiertes NZK vor und im Rahmen des follow-ups nach Nephrektomie treten in Abhängigkeit vom Primärstadium in 13-30 % der Fälle innerhalb von 36 bis 48 Monaten Metastasen auf. In diesen Fällen wird eine systemische Therapie empfohlen. Das in den Karzinomzellen erhöhte ABC-Transporter-Expressionslevel (im Speziellen p-Glykoprotein) führt jedoch zu einer natürlichen Resistenz der Tumorzellen gegenüber konventionellen Chemotherapeutika. Die Therapie des metastasierten NZK erfolgt daher im Rahmen der Systemtherapie mittels Multi-Kinase-Inhibitoren, Zytokinen, mTOR-Inhibitoren und Checkpoint-Inhibitoren. Vor dem Hintergrund des heterogenen Ansprechens auf die Immuntherapie ist die immunmodulatorische Aktivität der regulatorischen T-Zellen (Treg) Gegenstand der Forschung. Von maßgeblichem Interesse ist insbesondere die endogene Immunsuppression durch die Treg-Zellen. Im Rahmen einer Immuntherapie besteht hier ein Ansatzpunkt, um eine optimale Modulation mit verstärkter Tumorabwehr zu erreichen. Zu diesem Zweck ist eine effiziente Isolationsmethode von TIL aus Tumorfrischgewebe mit hoher vitaler Zellausbeute und einer aus-reichenden Menge an intakten TIL unabdingbar. Als Standardmethode zur Isolation von tumorinfiltrierenden T-Zellen im Rahmen der weiter-führenden Zellanalyse dienen bisher meist Protokolle, die Kollagenase zum Gewebeaufschluss verwenden. Die Kollagenase ist eine natürlicherweise beim Menschen vorkommende Peptidase und liegt in unterschiedlichen Subtypen vor. Aufgrund der hohen vitalen Zell-ausbeute galt diese Methode lange Zeit als Mittel der Wahl. Durch die proteolytische Eigenschaft der Kollagenase kommt es jedoch unter anderem zu einer Veränderung membrangebundener Rezeptoren und Oberflächenmoleküle von T-Zellen. Dies erweist sich als problematisch, da intakte Zellstrukturen und Oberflächenmolekülprofile eine unabdingbare Voraussetzung für hochauflösende durchflusszytometrische Messungen oder in vitro Zellkultur-Assays darstellen. Um die Treg-Zellpopulationen im Nierentumorgewebe mittels Immunfluoreszenzverfahren genauer analysieren zu können, verwendeten wir gemäß etablierter Protokolle zunächst das Kollagenase-basierte Protokoll zur Herstellung einer Einzelzellsuspension. Wir stellten fest, dass sich der enzymatische Gewebeaufschluss signifikant negativ auf die Fluoreszenzintensität unterschiedlicher Oberflächenmarker auswirkte. Dies führte zu einer Verfälschung der durchflusszytometrischen Messergebnisse, sodass zur genaueren Analyse der T-Zellen und auch der Treg-Zellen die Etablierung eines kollagenasefreien Protokolls notwendig war. Es wurden im Vergleich zur rein enzymatischen Methode eine kombiniert enzymatisch-mechanische und eine rein mechanische Methode (MiniLys©) untersucht. Der rein mechanische Gewebeaufschluss zeigte sich in Bezug auf die Zellausbeute als gleichwertig. Im Hinblick auf die Gewebestruktur zeigte sich diese Methode bei Tumoren von harter Konsistenz sogar signifikant überlegen gegenüber den rein enzymatisch prozessierten Proben. Des Weiteren zeichnet sich das MiniLys©-Protokoll neben einem geringeren Zeitaufwand insbesondere durch eine geringe Menge an benötigtem Tumormaterial aus. Diese Effizienz der Isolationsmethode ist besonders relevant im Hinblick auf die Stadienverteilung bei Diagnose des NZK. So wird aktuell in 65 % der Fälle im lokal begrenzten Stadium der Erkrankung operiert (Howlader N 2018). Die vorliegende Arbeit zeigt, dass die rein mechanische Methode eine mögliche Alternative zum enzymatischen Verdau darstellt und dieser in den oben genannten Punkten teilweise signifikant überlegen ist. Als Ergebnis konnte daher das „MiniLys“©-Protokoll „a-20 Sek.“ als neues Standardprotokoll (SOP) zur zukünftigen Herstellung von Einzel-Zellsuspension aus frischem Nierentumorgewebe etabliert werden.