The mammalian Translocon-Associated Protein (TRAP) complex and co- translational protein transport

Abstract

In eukaryotes, many proteins translocate into the endoplasmic reticulum (ER) and some insert themselves into the membrane. In 1971, G. Blobel proposed the “Signal Hypothesis”, explaining how proteins translocate from the cytosol into the ER. The signal peptides (SPs) have a tripartite structure but heterogeneous peptide sequence composition. SP complexity is essential for many processes, such as signal recognition particle binding, translocon gating, early folding prevention, and signal peptidase interaction/cleavage, as well as post-cleavage functions, such as antigen presentation. ER protein translocation takes place through the heterotrimeric Sec61 protein-conducting channel (PCC). Sec61α is a multi-spanning membrane protein that forms a complex with the single-spanning partners Sec61β and Sec61γ. During co-translational translocation, Sec61 is associated with the ribosome (via two cytosolic loops) and many accessory components (ribosome-channel complex), such as the translocon-associated protein (TRAP) complex. TRAP has four subunits—TRAP α (ssr1), TRAP β (ssr2), TRAP γ (ssr3), and TRAP δ (ssr4). The subunits α, β, and δ are single-spanning transmembrane (TM) proteins with luminal and cytosolic domains (type I), while the subunit γ has four TM domains and a prominent cytosolic domain. Recently, microscopic techniques, such as cryo-EM and cryo-ET, have enabled the determination of the translocation machinery structure. However, at present there is a lack of understanding regarding the roles of some of its components and domains. Protein function is determined by many different aspects, including localisation, sequence, structure, expression, post- translational modifications, and interactions. The present study aimed to contribute to the understanding of TRAP functions. Analyses of protein-protein interactions (PPIs), sequences (motifs), and expressions were carried out using experimental and computational methods. Importantly, we found that the TRAP complex interacts with the translocon Sec61 (peptide array). These PPIs may be essential for translocating substrates or stabilising translocon machinery. The PPIs occur in the ER luminal side between Sec61α1 loop 5 and TRAP α/β subunits. The latter also interact with one another, as is expected for elements of a complex (pull-down assays). The computational analysis identified a calcium-binding domain at the N-terminus of the TRAP α subunit, which may have a functional role. In Eukaryonten müssen viele Proteine in das ER transferiert werden, und einige von ihnen werden in die Membran eingebracht. Ein Meilenstein im Verständnis der Protein-Translokation ist die von G. Blobel 1971 vorgeschlagene "Signalhypothese", die erklärt, wie die Proteine aus dem Cytosol in das ER transloziert werden. Das Signalpeptid (SP) hat typischerweise eine dreiteilige Struktur, ist aber in der Aminosäuresequenz sehr heterogen, was eine schnelle Entwicklung im Verlauf der Evolution impliziert, die wahrscheinlich mit dem reifen Protein verbunden ist. Heutzutage wissen wir, dass die Komplexität des SP mit vielen biologischen Prozessen verbunden ist: Signalerkennungspartikel (SRP)-Bindung, translokale Interaktion (Gating), frühe Faltungsprävention, Signalpeptidase (SPase)-Interaktion und - Spaltung und sogar Post-Cleavage- Funktionen wie Antigenpräsentation. Die Translokation erfolgt über einen heterotrimeren proteinleitenden Kanal (PCC): Sec61α ist ein multi- spannendes Membranprotein und bildet mit den Single-Spanning-Partnern Sec61β und Sec61γ einen Komplex. Während der kotranslationalen Translokation ist Sec61 dem Ribosom (über zwei zytosolische Schleifen) und einer großen Anzahl von weiteren Komponenten zugeordnet (RCC, Ribosom-Kanal- Komplex). Zu diesen zusätzlichen Bestandteilen gehört der heterotetramere Translocon-Associated Protein (TRAP)-Komplex aus TRAP α (ssr1), TRAP β (ssr2), TRAP γ (ssr3) und TRAP δ (ssr4). Die Untereinheiten α, β und δ sind Single-Spanning- Transmembran (TM)-Proteine mit ER-luminalen und zytosolischen Domänen, während die γ Untereinheit vier TM-Domänen und eine prominente zytosolische Domäne aufweist. In letzter Zeit wurden große Fortschritte bei der Untersuchung der Struktur der Translokationsmaschinen erzielt, auch dank der verbesserten mikroskopischen Techniken wie Cryo-EM und Cryo-ET; die Forschung hat jedoch stets gezeigt, dass das Verständnis für die Rolle(n) einiger ihrer Komponenten und Domänen fehlt. Eine Proteinfunktion wird unter Berücksichtigung vieler Aspekte untersucht: intrazelluläre Lokalisation, Sequenz, Struktur, Expressionsprofil, post-translationale Modifikationen, Interaktionen. Der Hauptzweck dieser Forschungsarbeit ist es, zum Verständnis der TRAP- Funktion(en) beizutragen, indem Sequenzen (Motive), Expressionen und vor allem Protein- Protein-Interaktionen innerhalb des Komplexesund mit den umgebenden Strukturen durch computergestützte und experimentelle Methoden analysiert werden. Die relevanteste Erkenntnis ist, dass der TRAP-Komplex mit dem Translokon interagiert (Peptid- Array). Diese Wechselwirkungen könnten für die Translokation einiger Substrate oder auch nur für die Stabilisierung der Translokomaschinerie von wesentlicher Bedeutung sein. Die Interaktionen finden auf der ER-Lumenseite zwischen Sec61α1 loop 5 und den TRAP α /β Untereinheiten statt, letztere interagieren auch untereinander, wie es für Elemente eines Komplexes erwartet wird (Pulldown-Assay). Die Computeranalyse zeigt eine Calcium- Bindungsdomäne am N-Terminus der TRAP alpha Untereinheit auf, die eine funktionelle Rolle spielen könnte.

In Eukaryonten müssen viele Proteine in das ER transferiert werden, und einige von ihnen werden in die Membran eingebracht. Ein Meilenstein im Verständnis der Protein-Translokation ist die von G. Blobel 1971 vorgeschlagene "Signalhypothese", die erklärt, wie die Proteine aus dem Cytosol in das ER transloziert werden. Das Signalpeptid (SP) hat typischerweise eine dreiteilige Struktur, ist aber in der Aminosäuresequenz sehr heterogen, was eine schnelle Entwicklung im Verlauf der Evolution impliziert, die wahrscheinlich mit dem reifen Protein verbunden ist. Heutzutage wissen wir, dass die Komplexität des SP mit vielen biologischen Prozessen verbunden ist: Signalerkennungspartikel (SRP)-Bindung, translokale Interaktion (Gating), frühe Faltungsprävention, Signalpeptidase (SPase)-Interaktion und - Spaltung und sogar Post-Cleavage- Funktionen wie Antigenpräsentation. Die Translokation erfolgt über einen heterotrimeren proteinleitenden Kanal (PCC): Sec61α ist ein multi- spannendes Membranprotein und bildet mit den Single-Spanning-Partnern Sec61β und Sec61γ einen Komplex. Während der kotranslationalen Translokation ist Sec61 dem Ribosom (über zwei zytosolische Schleifen) und einer großen Anzahl von weiteren Komponenten zugeordnet (RCC, Ribosom-Kanal- Komplex). Zu diesen zusätzlichen Bestandteilen gehört der heterotetramere Translocon-Associated Protein (TRAP)-Komplex aus TRAP α (ssr1), TRAP β (ssr2), TRAP γ (ssr3) und TRAP δ (ssr4). Die Untereinheiten α, β und δ sind Single-Spanning- Transmembran (TM)-Proteine mit ER-luminalen und zytosolischen Domänen, während die γ Untereinheit vier TM-Domänen und eine prominente zytosolische Domäne aufweist. In letzter Zeit wurden große Fortschritte bei der Untersuchung der Struktur der Translokationsmaschinen erzielt, auch dank der verbesserten mikroskopischen Techniken wie Cryo-EM und Cryo-ET; die Forschung hat jedoch stets gezeigt, dass das Verständnis für die Rolle(n) einiger ihrer Komponenten und Domänen fehlt. Eine Proteinfunktion wird unter Berücksichtigung vieler Aspekte untersucht: intrazelluläre Lokalisation, Sequenz, Struktur, Expressionsprofil, post-translationale Modifikationen, Interaktionen. Der Hauptzweck dieser Forschungsarbeit ist es, zum Verständnis der TRAP- Funktion(en) beizutragen, indem Sequenzen (Motive), Expressionen und vor allem Protein- Protein-Interaktionen innerhalb des Komplexesund mit den umgebenden Strukturen durch computergestützte und experimentelle Methoden analysiert werden. Die relevanteste Erkenntnis ist, dass der TRAP-Komplex mit dem Translokon interagiert (Peptid- Array). Diese Wechselwirkungen könnten für die Translokation einiger Substrate oder auch nur für die Stabilisierung der Translokomaschinerie von wesentlicher Bedeutung sein. Die Interaktionen finden auf der ER-Lumenseite zwischen Sec61α1 loop 5 und den TRAP α /β Untereinheiten statt, letztere interagieren auch untereinander, wie es für Elemente eines Komplexes erwartet wird (Pulldown-Assay). Die Computeranalyse zeigt eine Calcium- Bindungsdomäne am N-Terminus der TRAP alpha Untereinheit auf, die eine funktionelle Rolle spielen könnte.