The role of Trpc channels in the hormonal regulation of reproduction

Abstract

The hypothalamus is the control center of the endocrine system and it comprises of various nuclei that can regulate reproduction. Of the two main reproductive pathways, the classical hypothalamic-pituitary-gonadal (HPG) axis relies on gonadotropin-releasing hormone (GnRH) and the lactotroph axis depends on dopamine and prolactin. Little information is available regarding the physiological function of hypothalamic neurons and how they influence reproduction. GnRH – the so called master molecule of reproduction – is an important regulator of gonadotropin secretion from the anterior pituitary. GnRH acts via its receptor (GnRHR) not only in the pituitary but also in neurons of the hypothalamus. A mouse model in which GnRHR neurons were genetically-tagged using a green fluorescent protein (GFP) enabled me to show that indeed these neurons respond to GnRH, inducing a depolarization and increased action potential activity. I could show that an inward current was underlying this GnRH-induced depolarization in GnRHR neurons. Canonical transient receptor potential (Trpc) channels have been postulated to be involved in regulation of hormonal and homeostatic signals in the hypothalamus and subsequent reproduction. Especially Trpc5 was suggested to be linked to GnRHR activation in juvenile gonadotrops. In order to investigate whether the absence of Trpc channels – in particular Trpc5 – could influence the regulation of both reproductive pathways several mutant mouse lines were used. Only the loss of single members of the Trpc1, c4 and c5 subfamily caused a reduction of fertility in mice, whereas deletion Trpc5 showed the highest impact on reproductive capabilities. Trpc5-deficiency causes hypoprolactinemia in both female and male mice. In female mice the hypoprolactinemia co-occurs with oligoovulation and prolonged estrous cycle length. The HPG axis in these female mice is unbalanced causing decreased serum levels of follicle-stimulating hormone (FSH) and a slight mistiming of luteinizing hormone (LH) surges. Olfactory cues as well as copulatory stimuli of wildtype male mice were able to improve the hypoprolactinemic condition of Trpc5-deficient females in a preliminary set of experiments. In male mice reduced prolactin levels are connected with poor sperm motility (asthenozoospermia) and increased sperm count, whereas the HPG axis seems to be unaffected. In an attempt to determine the cause of hypoprolactinemia and resulting subfertility in female mice, dopaminergic neurons of the arcuate hypothalamic nucleus (ARC) were investigated at the cellular level. Dopaminergic neurons of the hypothalamus – especially of the ARC – maintain the regulation of prolactin release from lactotroph cells of the anterior pituitary and could be shown to be Trpc5 positive. One key feature of these neurons is their spontaneous infraslow rhythmic oscillatory burst activity. Trpc5 is crucial to maintain the spontaneous infraslow rhythmic oscillatory burst activity in dopaminergic ARC neurons. My data indicates Abstract VI that Trpc5 positively affects the onset of a burst, the burst duration and the voltage conducted during a burst. This suggests that Trpc5 is a limiting factor for burst frequency and the interval between bursts. Therefore, loss of Trpc5 increases the overall activity of dopaminergic ARC neurons, which in turn should increase the amount of dopamine released into the median eminence, subsequently suppressing prolactin secretion and inducing hypoprolactinemia. Besides the general role of Trpc5 in the upkeep of membrane oscillations, Trpc5 is an essential component of the prolactin feedback loop. Prolactin stimulation of dopaminergic ARC neurons causes the phosphorylation of signal transducer and activator of transcription (STAT) 5 as well as an increase in electrical activity. Loss of Trpc5 abolishes the electrical component of the prolactin feedback loop but not the phosphorylation of STAT5. Therefore Trpc5-deficient dopaminergic ARC neurons lose their ability to fully respond to prolactin stimulation and to participate conventionally in the short loop feedback. This thesis provides conclusive evidence for the influence of Trpc5 in dopaminergic neurons of the arcuate nucleus upon prolactin regulation in the pituitary gland. Moreover, Trpc5 channelopathies as a cause for prolactin dysregulation or other dysfunctions or disease will be an interesting topic for further fundamental research on Trpc channels.

Der Hypothalamus ist das Kontrollzentrum des endokrinen Systems und besteht aus verschiedenen Kernen, die die Fortpflanzung regulieren können. Von den beiden regulatorischen Achsen der Fortpflanzung ist die klassische Hypothalamus-Hypophysen-Gonaden-Achse (HPG-Achse) auf das Gonadoliberin (engl.: gonadotropin-releasing hormone; GnRH) und die laktotrope Achse auf Dopamin und Prolaktin angewiesen. Über die physiologische Funktion von hypothalamischen Neuronen und deren Einfluss auf die Reproduktion ist bisher nur wenig bekannt. GnRH, das sogenannte Mastermolekül der Reproduktion, ist ein bedeutender regulatorischer Faktor für die Freisetzung der Gonadotropine aus der Hypophyse. GnRH wirkt über seinen Rezeptor (GnRHR) nicht nur in der Hypophyse, sondern auch an Neuronen des Hypothalamus. Ein Mausmodell, in dem GnRHR-Neurone unter Verwendung eines grün fluoreszierenden Proteins (GFP) genetisch markiert wurden, ermöglichte mir den Nachweis, dass diese Neurone tatsächlich auf GnRH reagieren und eine Depolarisation sowie eine Erhöhung der Aktionspotentialfrequenz auslösen. Ich konnte zeigen, dass ein Einwärtsstrom der GnRH-induzierten Depolarisation in GnRHR-Neuronen zugrunde liegt. Es wurde postuliert, dass kanonische Rezeptor-Potential-Kanäle (Trpc-Kanäle) an der Regulation hormoneller und homöostasischer Signale im Hypothalamus und dadurch an der Reproduktion beteiligt sind. Insbesondere wurde Trpc5 mit der GnRHR-Aktivierung in juvenilen Gonadotropen in Verbindung gebracht. Um zu untersuchen, ob das Fehlen von Trpc-Kanälen, insbesondere Trpc5, die Regulation beider Reproduktionswege beeinflussen könnte, wurden mehrere mutierte Mauslinien verwendet. Der Verlust von Trpc1, c4 oder c5 führte zu einer Verringerung der Fertilität bei Mäusen. Ein Mangel an Trpc5 zeigte den größten Einfluss auf die Fortpflanzungsfähigkeit, wohingegen das Ausschalten mehrerer Trpc-Kanäle nicht zu einer verminderten Fruchtbarkeit führte. Trpc5-Mangel verursacht Hypoprolaktinämie bei weiblichen und männlichen Mäusen. Bei weiblichen Mäusen tritt die Hypoprolaktinämie gleichzeitig mit einer Oligoovulation und einem verlängerten Östruszyklus auf. Die HPG-Achse bei diesen weiblichen Mäusen ist unausgewogen, was zu einem verminderten Serumspiegel des follikelstimulierenden Hormons (FSH) und eine Variabilität des Anstiegs des luteinisierenden Hormons (LH) führt. Olfaktorische sowie kopulatorische Stimuli von männlichen Wildtyp-Mäusen konnten die Hypoprolaktinämie von Trpc5-defizienten weiblichen Tieren in einer vorläufigen Reihe von Experimenten lindern. Bei männlichen Mäusen ist ein reduzierter Prolaktinspiegel mit einer schlechten Spermienmotilität (Asthenozoospermie) und einer erhöhten Spermienzahl verbunden, wohingegen die HPG-Achse bei Männern nicht beeinflusst zu sein scheint. Zusammenfassung VIII In einem Versuch, die Ursache der Hypoprolaktinämie und die daraus resultierende Subfertilität bei weiblichen Mäusen zu bestimmen, wurden dopaminerge Neurone des hypothalamischen Nucleus arcuatus (ARC) auf zellulärer Ebene untersucht. Dopaminerge Neurone des Hypothalamus, insbesondere des ARC, regulieren die Freisetzung von Prolaktin durch laktotrope Zellen der Adenohypophyse. Es konnte gezeigt werden, dass diese dopaminergen Neurone Trpc5 exprimieren. Ein Schlüsselmerkmal dieser Neurone ist ihre spontane, niederfrequente, oszillierende Burst-Aktivität. Trpc5 ist essenziell, um diese niederfrequenten Oszillationen in dopaminergen ARC Neuronen aufrecht zu erhalten. Meine Ergebnisse zeigen, dass Trpc5 einen positiven Einfluss auf die initiale Phase, die Dauer und die geleitete Spannung eines Burst nimmt. Dies legt nahe, dass Trpc5 ein limitierender Faktor der Burst-Frequenz und des Intervalls zwischen den Bursts darstellt. Ein Verlust von Trpc5 würde deshalb eine erhöhte Aktivität der dopaminergen ARC Neurone, dadurch eine erhöhte Freisetzung von Dopamine in die Eminentia mediana, eine Unterdrückung der Prolaktinsekretion und somit eine Hypoprolaktinämie verursachen. Neben der allgemeinen Funktion von Trpc5 in der Aufrechterhaltung von Membranoszillationen ist Trpc5 ein wesentlicher Bestandteil der Prolaktin-Rückkopplungsschleife. Eine Stimulation von dopaminergen ARC Neuronen mit Prolaktin bewirkt die Phosphorylierung von Signaltransduktor und Aktivator der Transkription (STAT) 5, sowie eine Erhöhung der elektrischen Aktivität. Ein Knockout von Trpc5 hebt die elektrische Komponente der Prolaktin-Rückkopplungsschleife, jedoch nicht die Phosphorylierung von STAT5, auf. Hierdurch verlieren Trpc5-defiziente dopaminerge ARC Neurone ihre Fähigkeit, vollständig und adäquat auf eine Prolaktin-Stimulation zu reagieren und somit ihre Rolle in der Rückkopplungsschleife zu übernehmen. Diese Arbeit liefert schlüssige Beweise dafür, dass Trpc5 in dopaminergen Neuronen des ARC die Prolaktinregulation in der Hypophyse direkt beeinflusst und dass Trpc5-Kanalopathien, als Ursache für Prolaktindysregulation, andere Funktionsstörungen oder Krankheiten, spannende Themen für die weitere Grundlagenforschung an Trpc-Kanälen sein werden.