Der Einfluss des multifunktionalen extrazellulären Adhäsionsproteins (Eap) von Staphylococcus aureus auf die Morphologie und Funktion von eukaryotischen Zellen

Abstract

Zusammenfassung Staphylococcus aureus ist eines der bedeutendsten Pathogene unserer Zeit und ein Hauptverursacher chronischer Wundinfektionen. Der Grund, warum dieses, normalerweise kommensalisch auf Schleimhäuten vorkommende, Bakterium einen so erfolgreichen opportunistischen Erreger darstellt, ist sein umfangreiches Arsenal aus zusammen wirkenden Virulenzfaktoren. Diese helfen dem Keim, durch Bindung an Wirtsstrukturen eine Infektion zu etablieren und diese durch Modulation des Immunsystems aufrechtzuerhalten. Einer dieser Faktoren ist das zu der Gruppe der SERAM (engl. "secretable expanded repertoire adhesive molecules") zählende, von S. aureus in das extrazelluläre Milieu sekretierte extrazelluläre Adhäsionsprotein (Eap). In früheren wissenschaftlichen Arbeiten konnte bereits gezeigt werden, dass Eap zum Erhalt tief eindringender, nicht-heilender Wunden beiträgt, indem es die Einwanderung und Proliferation von Immunzellen hemmt und durch diese biochemische Barriere die Bereinigung der sich in der Wunde vermehrenden Bakterien vermindert. Zudem inhibiert das in tiefen Wunden stark durch S. aureus exprimierte Protein die Neovaskularisierung des neu gebildeten Gewebes und unterbindet dadurch den Stofftransport dieses Wundgebiets, was in einem verzögerten Wundschluss resultiert. In meiner Arbeit wird mit Hilfe verschiedener Methoden gezeigt, dass Eap auf drei der wichtigsten, an der Wundheilung beteiligten Zelltypen - Keratinozyten, Endothelzellen und Fibroblasten - einen direkten proliferations- und migrationshemmenden Einfluss zeigt. Dies könnte in nativen Wunden dazu führen, dass es zu einer verminderten Ausbildung einer neuen extrazellulären Matrix durch Fibroblasten, einer eingeschränkten Bildung eines neuen Gefäßsystems durch Endothelzellen und zu einer deutlichen Verzögerung der abschließenden Überhäutung der Wunde durch Keratinozyten kommt. Ein Teil dieses Effekts besteht in der bereits in früheren Studien beschriebenen Unterbrechung der Signaltransduktion über die Mitogen-aktivierte Kinase-Kaskade (MAPKK), welche Zellfuktionen wie Zellvermehrung und Bewegung reguliert. Meine Arbeit zeigt jedoch auch, dass Eap die Morphologie und Adhäsion von Zellen am Substrat beeinflussen kann. Mit Eap behandelte Keratinozyten verändern ihre Form von elongiert-keilförmig zu rund, werden dabei flacher und zeigen eine verminderte, zelluläre Steifigkeit. Diese Änderungen gehen mit einer verminderten zellulären Mobilität und Teilungsfähigkeit einher und tragen so vermutlich zum Erhalt der chronischen Wunden bei. In einem zweiten Teil dieser Arbeit wird ein bis dato vollkommen neuer Aspekt der adhäsiven Fähigkeiten von Eap beschrieben. Es konnte gezeigt werden, dass das stark kationische Adhäsionsprotein in der Lage ist, DNA zu binden und diese zu aggregieren. Eap kann dabei jedoch nur an lineare DNA-Molekühle, nicht jedoch an zirkuläre Strukturen, wie Plasmide binden. Die Spezies aus der die DNA stammt, scheint dabei keine Rolle zu spielen. Ebenso wenig, wie die endständige Konfiguration mit "sticky", oder "blunt"-Enden der DNA-Moleküle. Diese Fähigkeit ist als weitere immunmodulatorische Fähigkeit dieses Proteins anzusehen, die dem Keim hilft, den aus dekondensiertem Chromatin bestehenden NETs (engl. "Neutrophil extrazellular traps") neutrophiler Granulozyten zu entkommen. Zusammen mit der bereits beschriebenen Inhibition der neutrophilen Serinproteasen, ist Eap damit in der Lage, diesen bedeutenden angeborenen Immunmechanismus auf verschiedenen Ebenen zu adressieren und S. aureus damit den Erhalt der Infektion zu ermöglichen. In einem dritten Forschungsschwerpunkt wird gezeigt, ob die zuvor beschriebenen anti-proliferativen und migrationshemmenden Eigenschaften von Eap das Protein zu einem potentiellen Kandidaten für ein Krebstherapeutikum machen. Mit der Blase als von außen zugängliches System, das keinen intravenösen Zugang erfordert, wurde hier im Hinblick auf eine zukünftige Anwendbarkeit das Blasenkarzinom gewählt. Urothelkarzinome stellen die fünfthäufigste Krebsart der westlichen Welt dar und betreffen in über 90% aller Fälle die Blase. Es entspricht der etablierten Vorgehensweise, nach der operativen Tumorresektion die Blase mit Chemotherapeutika zu spülen. Dabei wird davon ausgegangen, dass in der Blase zirkulierende Tumorzellen innerhalb der ersten drei post-operativen Tage dazu in der Lage sind, an das beschädigte Blasenepithel zu re-adhärieren und so neue Tumorherde zu entfachen. Da die etablierten Therapeutika stark variierende Effektivitäten aufweisen, ist die Entwicklung neuer, effektiverer Agenzien nach wie vor von größter Bedeutung. Die von mir gewonnen Erkenntnisse zu den Blasenkrebslinien RT-112 und 5637 zeigen, dass Eap auch bei diesen Zellen die Fähigkeit zur Migration und Proliferation beeinträchtigt. Mit Hilfe der Rasterkraftmikroskopie (AFM, "atomic force microscope") konnten für RT-112 Zellen zudem ähnliche, morphologische Effekte wie bei Keratinozyten beobachtet werden. Zusätzlich konnte mittels eines Antikörper-basierten Immunfluoreszenzassays (AlphaLisa) eine Eap induzierte Inhibition der MAPKK und einiger nachfolgender Zellfunktionen (Proliferation, Mobilität, Morphologie) in RT-112 Zellen nachgewiesen werden, wie sie bereits für Keratinozyten und Endothelzellen bekannt war. Die hier gewonnenen Erkenntnisse betonen erneut die Multifunktionalität des initial als Adhäsin beschriebenen Immunmodulators Eap. Seine Eigenschaften, die Teilung und Mobilität von Zellen verschiedener Abstammung zu beeinflussen, machen es zudem zu einem vielversprechenden Kandidaten zur Etablierung neuer antikanzerogener Therapien.

Summary Staphylococcus aureus is one of the most important pathogens of our time and a major cause of chronic wound infections. One reason why this commensal bacterium, which usually persists on mucous membranes, represents such a successful opportunistic pathogen, is its extensive armamentarium of virulence factors. These factors contribute to the establishment of infections by binding to host structures and to its perpetuation by modulating the host immune system. One of these factors is the "extracellular adherence protein" (Eap), which belongs to the secreted expanded repertoire adhesive molecules (SERAM). Earlier work showed that Eap contributes to the maintenance of wounds by inhibiting the immigration and proliferation of immune cells, thereby reducing the clearance of bacteria in the wounded tissue. This protein, which is strongly expressed in deep-seated wounds, also inhibits the neovascularization of the newly formed tissue and thereby prevents the transport of nutrients into the wound area, resulting in a delayed wound closure. My thesis shows with the aid of different assays, that Eap has a direct proliferation- and migration-inhibiting influence on three of the most important cell types which are related to wound healing - keratinocytes, endothelial cells and fibroblasts. We hypothetize that in native wounds, these effects could have inhibiting impacts on the formation of a new extracellular matrix by fibroblasts, the formation of a new vascular system by endothelial cells and the final coverage of the wound by keratinocytes. At least part of this effect is mediated by the Eap-driven attenuation of the "mitogen-activated kinase cascade" (MAPKK) signal transduction pathway, which is known to regulate cell functions such as proliferation and movement. The present work also shows that Eap affects the morphology and adhesion properties of host cells to its substrate. Eap-treated keratinocytes change their shape from elongated-wedge-shaped to round cells, and this morphological change is accompanied by a flattening of the cell and a diminished cellular stiffness. These changes probably contribute to the marked reduction of cellular mobility and the ability to divide, thereby contributing to the preservation of chronic wounds. In a second part of my thesis, a completely new aspect of Eap's adhesive capabilities is described. It was shown that the cationic protein is able to bind to DNA and to aggregate it. Eap thereby only binds to linear DNA-molecules, but not to circular structures like plasmids. The species origin of the DNA, as well as the terminal configuration like "sticky", or "blunt" does not seem to matter in this background. This ability is considered to be a new immunomodulatory mechanism that contributes to the bacteriums ability to escape from entrappment by "neutrophil extracellular traps" (NETs), consisting of decondensed chromatin that is excreted by neutrophil granulocytes upon stimulation by a number of internal and external signals. This observation demonstrates that Eap, together with the previously described inhibition of neutrophil serine proteases, is able to modulate this important innate immune mechanism by various means, and thereby enables S. aureus to maintain the infection. A third focus of my thesis was to verify, if the afore mentioned anti-proliferative and anti-migration properties of Eap qualify this protein to become a potential candidate for new cancer therapeutic agents. With the bladder as an externally accessible system that does not require intravenous access, bladder cancer was chosen as a suitable target. Urothelial carcinomas are the fifth most common cancer forms of the western hemisphere, and affect the bladder in over 90% of all cases. The currently used operative procedure includes rinsing of the bladder with chemotherapeutic agents after surgical tumor resection. This procedure is based on the assumption that the resection process induces a certain release of tumor cells, which are subsequently circulating in the bladder and may re-adhere to the damaged bladder epithelium within the first three post-operative days leading in new tumor foci. Since all currently established therapeutics are afflicted by largely varying efficiencies, the development of new agents and/or adjuvant strategies is of high-ranking importance. My findings obtained for the bladder cancer lines RT-112 and 5637 demonstrate that Eap also impairs the migration and proliferation abilities of these cancer cell types. Atomic force microscope (AFM) studies confirmed that Eap also exerts a morphological effect on RT-112 cells similar to the one seen with keratinocytes. An antibody-based immunofluorescence assay (AlphaLisa) allowed to detect an Eap-dependent inhibition of MAPKK and all its subsequent functions, in line with previous findings made with keratinocytes and endothelial cells. The findings of my thesis emphasize the role of Eap as immunomodulator, which was initially described as an adhesin. Its ability to influence the proliferation and mobility of various cell types including tumor cells support the idea that Eap might constitute a promising candidate for the establishment of new anti-cancer therapies.