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doi:10.22028/D291-31412
Titel: | Structural and Functional Characterisation of TRP channels |
VerfasserIn: | Xian, Wenying |
Sprache: | Englisch |
Erscheinungsjahr: | 2018 |
Erscheinungsort: | Homburg/Saar |
Kontrollierte Schlagwörter: | TRP-Kanäle |
DDC-Sachgruppe: | 610 Medizin, Gesundheit |
Dokumenttyp: | Dissertation |
Abstract: | Die Familie der TRP-Rezeptorkanäle (TRP= ‘’transient receptor potential“) umfasst in
Säugergewebe 28 Mitglieder, welche in 6 Subfamilien untergliedert sind: TRPC, TRPM,
TRPV, TRPA, TRPP und TRPML. TRP-Kanäle spielen in verschiedenen
physiologischen, sowie pathologischen Prozessen eine wichtige Rolle. In dieser Arbeit
lag der Fokus zum einen auf dem TRPM4-Kanal, welcher zu der TRPM Subfamilie
gehört und zum anderen auf den TRPC1- und TRPC4- Kanäle, welche der TRPC
Familie zugeordnet werden können.
TRPM4 ist ein Kalzium-aktivierter, nichtselektiver Kationen-Kanal. Jüngste Studien
legen nahe, dass TRPM4 als potentielles therapeutisches Ziel für eine Reihe erblich
bedingter Herzrhythmusstörungen dienen kann. Mutationen im TRM4-Gen sind mit
atrioventrikulärem (AV) Block im Kindesalter, familiärer progressiver kardialer
Reizleitungsstörungen (Typ I) sowie dem Brugada-Syndrom assoziiert. Allerdings sind
bis heute nur wenige dieser Mutationen gut untersucht und der zugrundeliegende
Pathomechanismus ist nach wie vor unklar. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden zum
einen UV-Blitzlicht-Photolyse von „caged“ Kalzium und quantitatives Kalzium-, sowie
elektrophysiologische Messungen durchgeführt, um die Eigenschaften von TRPM4-
Kanälen detailliert zu analysieren. Die Ergebnisse zeigen, dass die TRPM4A432T
Mutation, welche mit einer erblichen Herzrhythmusstörung assoziiert ist, mit einer
zweifach höheren Stromdichte und einer vierfach verlangsamten Kalzium-abhängige
Deaktivierung einhergeht. Diese Veränderungen scheinen für die pathologische
Aktionspotenzialform verantwortlich zu sein. In dieser Arbeit konnte ich im
Zusammenspiel von Experiment und molekularer Modellierung erstmalig aufzeigen,
dass die Größe der Aminosäure an Position 432 eine substanzielle Determinante für
das Deaktivierungsverhalten des TRPM4 Kanals ist. Weiterhin habe ich mit Hilfe der
UV-Blitzlicht Analyse systematisch 9 weitere humane TRPM4-Mutationen untersucht.
Dabei konnte gezeigt werden, dass 5 Mutationen veränderte TRPM4-Eigenschaften
auswiesen (Kalzium-Empfindlichkeit, Aktivierung und Deaktivierung, veränderte
Membranströme). 4 TRPM4-Mutationen hatten keinen Einfluss auf die von mir
untersuchten TRPM4-Eigenschaften. TRPC-Kanäle besitzen die Fähigkeit, Homo-, oder Heterotetramere-Kanalstrukturen zu
bilden. Das TRPC4/TRPC1-Heterotetramer wurde bereits ausführlich beschrieben und
weist im Vergleich zu TRPC1 oder TRPC4 Homomeren sehr unterschiedliche
biophysikalische Eigenschaften auf. Durch die Mangan-Quench und Patch-Clamp
Methoden konnten im zweiten Teil der Arbeit gezeigt werden, dass das TRPC1-
Homotetramer keine Rezeptor-aktivierten Kanäle bilden. Im Gegensatz dazu kann
TRPC1 mit TRPC4 interagieren und bildet dann einen heteromeren Kanal
(TRPC4/TRPC1-Kanal). Dieser zeigte allerdings im Gegensatz zum TRPC1 Homomer
einen verringerten Kalzium-Einstrom. Um die molekularen Hintergründe für dieses
charakteristische Merkmal von TRPC4/TRPC1 weiter zu untersuchen, wurden chimäre
Kanalproteine, TRPC1C4Pore und der TRPC4C1Pore erzeugt. Dieser Ansatz wurde
gewählt um zu zeigen, dass die Porenregion von TRPC1 entscheidend für die
physikalischen Eigenschaften des TRPC4/TRPC1-Heteromerkanals ist (z.B.
Stromstärke, Kalzium-Permeation). Zudem konnte ich in dieser Arbeit darlegen, dass
die G-S-Mutation im S4-S5-Linker von TRPC1 den Kalzium-Einstrom des
TRPC4/TRPC1-Kanal-Komplexes erhöhen kann.
Zusammenfassend liefern die in dieser Arbeit gewonnenen Ergebnisse nicht nur neue
Einblicke in den Pathomechanismus von mutierten TRPM4-Kanals bei erblich bedingter
Herzleitungsblockade, sondern deckten neue Ätiologien für humane
Herzrhythmusstörungen auf. Diese neuen Ätiologien stellen potenzielle
Zielmechanismen für neuartige Medikamente zur Behandlung dieser erblichen
Herzrhythmusstörungen dar. Die hier von mir vorgestellten neuen Ergebnisse zum
TRPC4/TRPC1 Kanal tragen zum Verständnis der Porenregion sowie des S4-S5-
Linkers von TRPC1 im TRPC4/TRPC1-Heteromer bei. The transient receptor potential (TRP) family includes 28 mammalian members, which have been categorized into six subfamilies: TRPC, TRPM, TRPV, TRPA, TRPP and TRPML. TRP channels play an important role in various physiological and pathological process. In this study, I focused on the TRPM4 channel a membrane of the TRPM subfamily and TRPC1 and TRPC4 channels from the TRPC subfamily. The TRPM4 channel is a Ca2+ activated, non-selective cation channel. Recently, studies suggested that TRPM4 could be a potential target for inherited human cardiac conduction blocks. Childhood atrioventricular block, isolated cardiac conduction disease and progressive familial heart block type I as well as the Brugada syndrome are associated with mutations in TRPM4 gene. However, only a few of these mutations have been well studied and the underlying pathological mechanism is still not understood. In the first part of my thesis, I used UV-flash photolysis of caged Ca2+, quantitative Ca2+ and electrophysiological measurements to investigate the properties of such TRPM4 channels. My results showed that the TRPM4A432T mutation, associated with isolated cardiac conduction disease, caused a two-fold increased current density and a four-fold slower deactivation which are most likely responsible for the increased membrane currents during human cardiac action potentials. Furthermore, I found that it is the bulkiness of the amino acid at position 432 that rendered TRPM4’s aberrant gating. Moreover, using the UV-flash approach, I systematically studied nine additional identified human TRPM4 mutations and revealed that five of them altered TRPM4’s properties including Ca2+ sensitivity, activation and deactivation gating as well as the maximal membrane current density, while four of them exhibited no apparent influence on TRPM4’s properties. TRPC channels are known to form tetrameric structures, such as homotetramers or heterotetramers. The TRPC4/TRPC1 heterotetramer has been widely reported and displays totally different biophysical properties when compared to TRPC1 or TRPC4 homotetramers. In the second part of my thesis, using the Mn2+ quench and patchclamp, I found that TRPC1 homotetramers failed to form receptor-activated channels, while TRPC1 could interact with TRPC4 to form a heteromeric channel TRPC4/TRPC1, that displayed less Ca2+ influx in comparison to TRPC4 homotetramers. To further investigate the molecular determinants for these distinctive characteristics of TRPC4/TRPC1, I used the chimeras TRPC1C4Pore and TRPC4C1Pore demonstrating that the pore region of TRPC1 is crucial for preserving the TRPC4/TRPC1 heteromeric channel’s physical properties such as its current amplitude, I-V relationship and Ca2+ permeation. Moreover, I found that the G-S mutation in the S4-S5 linker of TRPC1 could increase the Ca2+ permeation of the TRPC4/TRPC1 channel complex. In summary, these results from TRPM4 channels not only provide new insights into the pathological mechanisms of TRPM4 mutants in hereditary cardiac conduction blocks, but also reveal new etiologies for human cardiac arrhythmia. These new etiologies could be potential targets for novel drugs to treat these hereditary cardiac arrhythmias. These new results from the TRPC4/TRPC1 channels presented here make a contribution to understand roles of the pore region and the S4-S5 linker of TRPC1 in the TRPC4/TRPC1 heterotetramer. |
Link zu diesem Datensatz: | urn:nbn:de:bsz:291--ds-314125 hdl:20.500.11880/29380 http://dx.doi.org/10.22028/D291-31412 |
Erstgutachter: | Lipp, Peter |
Tag der mündlichen Prüfung: | 19-Jun-2019 |
Datum des Eintrags: | 6-Jul-2020 |
Fakultät: | M - Medizinische Fakultät |
Fachrichtung: | M - Anatomie und Zellbiologie |
Professur: | M - Prof. Dr. Carola Meier |
Sammlung: | SciDok - Der Wissenschaftsserver der Universität des Saarlandes |
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