Adipose tissue-derived microvascular fragments: In vitro and in vivo analysis of prevascularization strategies for dermal substitutes

Abstract

For the treatment of full-thickness skin defects, autologous split-thickness skin grafting is the gold standard. However, the outcome of this approach may be impaired by scarring, wound contraction, or the lack of vascularization within the wound bed. To counteract these problems, bioengineered off-the-shelf matrices, such as Integra® Matrix Wound Dressing (MWD), have been introduced over the past years. This collagen-glycosaminoglycan matrix with a silicone pseudo-epidermis is first implanted into the debrided wound bed. Only after a sufficient vascularization, the silicone layer is removed and the matrix can be covered with a split-thickness skin graft. Noteworthy, the ingrowth of blood vessels into the matrix requires up to 3 weeks. Since wound infection is a threat throughout this time, strategies are needed to improve the vascularization of the matrix. Prevascularization, which aims for the creation of microvascular networks within the matrix prior to its implantation, is such a strategy. Although the seeding of matrices with stem cells showed positive results in the creation of preformed networks, a time-consuming in vitro cultivation is necessary to generate the needed number of cells. Moreover, stem cells need too much time to vascularize the entire matrix. To overcome this problem, the seeding of matrices with adipose tissue-derived microvascular fragments (ad-MVF) has recently been introduced as a promising strategy. Ad-MVF can easily be isolated from adipose tissue and, unlike single cells, already represent fully functional blood vessel segments that rapidly reassemble into new microvascular networks within seeded matrices. However, although experimental studies indicate the benefits of ad-MVF as prevascularization units, many questions have to be clarified to allow a successful transfer of this novel approach into clinical practice, as outlined and analyzed in the present doctoral thesis. For all in vitro and in vivo parts of this thesis, green fluorescent protein (GFP)+ C57BL/6 mice were used as ad-MVF donor animals. The tissue of these animals appears green under blue light excitation, enabling the identification of ad-MVF after their transplantation into GFP- C57BL/6 recipient mice. Non-seeded and ad-MVF- or stromal vascular fraction (SVF)- seeded Integra® matrices were implanted into full-thickness skin defects within mouse dorsal skinfold chambers to analyze their vascularization, incorporation, oxygenation, and epithelialization by means of intravital fluorescence microscopy, photoacoustic imaging, histology, and immunohistochemistry over an observation period of 2 weeks. The aim of a first set of experiments was to clarify whether the volumes of epididymal adipose tissue and/or the numbers of ad-MVF depend on the age of the animal. For this purpose, 7 - 12 months old GFP+ C57BL/6 donor mice were used for harvesting their epididymal fat tissue and subsequent ad-MVF isolations. It was found that a comparable volume of ~ 1.4 mL fat tissue can be harvested from animals ranging between 7 - 12 months. Furthermore, a comparable number of ~ 40.000 ad-MVF/mL adipose tissue could be isolated from these mice. The isolated ad-MVF exhibited an average length of ~ 38 μm and a viability of > 90 %. This indicates that all mice of the analyzed age range can be used for a highly standardized isolation of ad-MVF. In a second set of experiments it was hypothesized that the seeding of ad-MVF on a flowable matrix, which allows a more homogeneous distribution, may result in a faster matrix vascularization and incorporation when compared to MWD. For this purpose, MWD as well as samples of Integra® Flowable Wound Matrix (FWM) were seeded with identical numbers of ad-MVF. Of interest, FWM exhibited a more homogeneous distribution of individual ad- MVF when compared to MWD. However, when implanted into full-thickness skin defects within GFP- C57BL/6 recipient mice, this resulted in an increased distance between individual ad-MVF, leading to a prolonged ad-MVF interconnection time as well as a reduced matrix vascularization and incorporation in vivo. These results indicate that MWD is more suitable for the treatment of rather large wounds, while FWM may be particularly used for the treatment of small wounds and wounds with irregular geometries which are hardly to access. In a third set of experiments it was hypothesized that the seeding density of ad-MVF is a crucial determinant for an adequate vascularization and incorporation of seeded matrices. For this purpose, MWD was seeded with three different densities of ad-MVF. The results indicate that a minimum density of ~ 80,000 ad-MVF/cm2 is required to guarantee a sufficient vascularization and incorporation of implanted MWD in vivo. Under clinical conditions, this may be particularly relevant for the treatment of patients with extensive skin defects and/or limited availability of adipose tissue. Besides the novel approach of ad-MVF prevascularization, the seeding of matrices with vessel-forming single cells of the SVF is a frequently applied strategy. In a fourth set of experiments it was hypothesized that the ad-MVF-based prevascularization of MWD is superior to the conventional SVF-based approach. While both ad-MVF and SVF isolates contained a comparable fraction of endothelial cells, perivascular cells, adipocytes, and stem cells, ad-MVF exhibited a significantly higher viability after their isolation. It was further shown that SVF-seeded MWD exhibited a reduced vascularization and incorporation when compared to ad-MVF-seeded MWD in vivo. These novel findings indicate that ad-MVF are highly potent vascularization units that may be even superior to SVF single cells in future tissue engineering applications. In a fifth set of experiments it was hypothesized that the anti-angiogenic properties of low molecular weight heparins (LMWH), such as enoxaparin (enox), prevent the reassembly of seeded ad-MVF into new microvascular networks. It was further hypothesized that the anticoagulative properties of enox may increase the bleeding risk during network formation within implanted MWD. To test these hypotheses, ad-MVF were isolated from enox- and vehicle-treated GFP+ C57BL/6 donor mice, seeded onto MWD and implanted into enox- and vehicle-treated GFP- recipient animals. Intravital fluorescence microscopic, histological, and immunohistochemical analyses revealed that enox does neither inhibit the reassembly of ad- MVF nor promotes implant-induced hemorrhage formation. These novel findings demonstrate that the seeding of MWD matrices with ad-MVF as prevascularization units may also be applied during thromboprophylactic therapy without any concern.

Obwohl die Deckung dermaler Wunden mittels autologer Spalthauttransplantate zur klinischen Standardbehandlung zählt, kann der Erfolg dieser Methode durch Komplikationen wie Narbenbildung, Wundkontraktionen oder eine ausbleibende Vaskularisierung des Wundbetts gefährdet werden. Um diese Probleme zu vermeiden, wurden in den letzten Jahren biosynthetische Matrices, wie beispielsweise Integra® Matrix Wound Dressing (MWD), entwickelt. MWD ist eine Kollagen-Glykosaminoglykan-Matrix, welche mit einer Pseudo-Epidermis aus Silikon bedeckt ist, um die Austrocknung der Wunde zu verhindern. Erst nach ausreichender Vaskularisierung der Matrix kann die Silikonschicht abgenommen werden und eine Deckung mit Spalthaut erfolgen. Da die Vaskularisierung bis zu 3 Wochen dauern kann und in diesem Zeitraum ein erhöhtes Infektionsrisiko besteht, müssen unbedingt neue Strategien zur Beschleunigung der Vaskularisierung solcher Matrices entwickelt werden. Ein solcher Ansatz ist die Prävaskularisierung, eine Methode, bei der mikrovaskuläre Netzwerke in einer Matrix vor deren Implantation generiert werden. Auch wenn die Besiedlung von Matrices mit Stammzellen bereits positive Ergebnisse bei der Herstellung prävaskularisierter Netzwerke gezeigt hat, sind dabei zeitaufwändige in vitro Kultivierungen unabdingbar, um eine ausreichende Zellzahl zu erhalten. Darüber hinaus benötigen Stammzellen zu viel Zeit, bis sie sich in der gesamten Matrix zu neuen Blutgefäßen entwickelt haben. Um diese Probleme zu vermeiden, wurde kürzlich die Prävaskularisierung von Matrices mit mikrovaskulären Fragmenten (ad-MVF) aus Fettgewebe als neue Strategie beschrieben. Ad-MVF können in großen Mengen durch enzymatische Digestion von Fettgewebe gewonnen werden und stellen, im Gegensatz zu Einzelzellen, bereits intakte Gefäßsegmente dar, welche sich innerhalb einer Matrix nur noch zusammenlagern müssen, um vollständige Netzwerke auszubilden. Auch wenn experimentelle Studien den Einsatz von ad-MVF als Prävaskularisierungseinheiten bereits als vielversprechend beschreiben, müssen noch wesentliche Fragen beantwortet werden, um diesen Ansatz erfolgreich in die Klinik einzuführen. Für alle in vitro und in vivo Versuche der vorliegenden Arbeit wurden green fluorescent protein (GFP)+ C57BL/6 Spendermäuse zur Fettgewinnung und Isolation von ad-MVF verwendet. Das Gewebe dieser Tiere erscheint unter Anregung mit blauem Licht grün und ermöglicht so die Identifikation von ad-MVF nach Implantation in GFP- Empfängertiere. Unbesiedelte und ad-MVF- oder stromal vascular fraction (SVF)-besiedelte Integra® Matrices wurden in Vollhautdefekte innerhalb von Rückenhautkammern implantiert und anschließend deren Vaskularisierung, Inkorporation, Oxygenierung und Epithelialisierung mittels intravitaler Fluoreszenzmikroskopie, photoakustischer Bildgebung, Histologie und Immunhistochemie über einen Zeitraum von 2 Wochen analysiert. In einem ersten experimentellen Teil wurde die Hypothese geprüft, ob die Menge an epididymalem Fettgewebe oder die Anzahl isolierbarer ad-MVF abhängig vom Alter des Spendertieres sind. Zu diesem Zweck wurden 7 - 12 Monate alte GFP+ C57BL/6 Mäuse verwendet, um deren epididymales Fett zu entnehmen und ad-MVF zu isolieren. Dabei konnte gezeigt werden, dass aus allen Spendermäusen ein vergleichbares Volumen von ~ 1,4 ml Fettgewebe gewonnen werden kann. Zusätzlich war es bei einer Viabilität von > 90 % möglich, aus allen 7 - 12 Monate alten Tieren ~ 40,000 ad-MVF/ml Fettgewebe zu isolieren, wobei diese eine mittlere Länge von ~ 38 μm aufwiesen. Diese Ergebnisse zeigen, dass aus 7 - 12 Monate alten Spendermäusen eine standardisierte Isolation von ad-MVF möglich ist. In einem zweiten experimentellen Teil wurde die Hypothese geprüft, ob eine homogenere Verteilung von ad-MVF in einer fließfähigen Matrix zu einer verbesserten in vivo Vaskularisierung führt. Hierzu wurden sowohl MWD als auch Einzelproben der Integra® Flowable Wound Matrix (FWM) mit einer identischen Anzahl von ad-MVF besiedelt. Auf diese Weise konnte gezeigt werden, dass FWM eine homogenere Verteilung von ad-MVF ermöglicht. Dies ging allerdings mit einer erhöhten Distanz einzelner ad-MVF zueinander einher und führte zu einer verlangsamten Netzwerkbildung. Entsprechend war auch die Vaskularisierung und Inkorporation der Matrices verzögert. Dieses Ergebnis zeigt, dass MWD zur Behandlung größerer Wunden eingesetzt werden sollte, während ad-MVFbesiedelte FWM eher in kleinen, irregulär geformten Wunden Anwendung finden könnte. In einem dritten experimentellen Teil wurde die Hypothese geprüft, ob eine zu geringe Dichte von ad-MVF bewirkt, dass eine ausreichende Vaskularisierung implantierter Matrices nicht mehr erfolgen kann. Hierzu wurden MWD mit 3 verschiedenen Dichten von ad-MVF besiedelt. Es konnte gezeigt werden, dass eine Mindestdichte von ~ 80,000 ad-MVF/cm2 MWD notwendig ist, um eine ausreichende Vaskularisierung und Inkorporation der Matrices zu erreichen. Dies ist im Speziellen für klinische Anwendungen wichtig, bei denen am Patienten große Defekte gedeckt werden müssen und/oder ein eingeschränktes Volumen an Fettgewebe für die Isolierung von ad-MVF vorhanden ist. Neben dem Besiedeln von Matrices mit ad-MVF beschreibt der Einsatz der SVF aus Fettgewebe eine klinisch bereits angewandte Methode der Prävaskularisierung. In einem vierten experimentellen Teil wurde die Hypothese geprüft, ob eine Prävaskularisierung mit ad-MVF dem konventionellen SVF-basierten Ansatz überlegen ist. Obwohl ad-MVF- und SVF-Isolate vergleichbare Anteile an Endothelzellen, perivaskulären Zellen, Adipozyten und Stammzellen aufwiesen, war die Viabilität von frisch isolierten ad-MVF höher. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass SVF-besiedelte Matrices eine schlechtere Vaskularisierung aufweisen. Diese Ergebnisse zeigen, dass auf Grund ihres hohen Vaskularisierungspotentials ad-MVF gegenüber SVF-Einzelzellen für zukünftige Tissue Engineering-Ansätze deutlich besser geeignet sein könnten. In einem fünften experimentellen Teil wurde die Hypothese geprüft, ob die anti-angiogene Wirkung von niedermolekularen Heparinen (LMWH), wie Enoxaparin (enox), die Netzwerkbildung von ad-MVF verlangsamt. Weiterhin wurde hypothetisiert, dass die antikoagulativen Eigenschaften von enox zu vermehrten Einblutungen während der Netzwerkausbildung innerhalb ad-MVF-besiedelter Matrices führen. Hierzu wurden ad-MVF von GFP+ C57BL/6 Mäusen isoliert, welche mit enox oder Vehikel behandelt wurden. Anschließend wurde MWD mit diesen ad-MVF besiedelt und passgenau in Vollhautdefekte innerhalb des Rückenhautkammermodells implantiert. Intravitalmikroskopische, histologische, und immunhistochemische Analysen konnten zeigen, dass enox weder die Netzwerkbildung von ad-MVF verschlechtert, noch Einblutungen innerhalb der Matrices begünstigt. Diese Ergebnisse belegen, dass eine Besiedelung von MWD mit ad-MVF als Prävaskularisierungseinheiten bei gleichzeitig angewandter Thromboseprophylaxe problemlos möglich ist.