Charakterisierung der physiologischen Funktionen des Sec61-assoziierten Ca2+-Leckstroms

Abstract

Der Sec61-Kanal spielt außer in der Proteintranslokation eine wichtige Rolle in der Ca2+- Homöostase der Zelle, da die kanalbildende α-Untereinheit für Ca2+ durchlässig ist. Ob dieser Ca2+-Leckstrom von der Zelle als physiologisches Signal und in einer Energieregulationsroute genutzt wird und wie bedeutend die kontrollierte Kanaldynamik für das Überleben der Zelle ist, zeigen die beiden in dieser Arbeit bearbeiteten Themenkomplexe. Im ersten Teil der Arbeit wurde eine PAD (primäre Antikörperdefizienz)-assoziierte Sec61α- Mutante untersucht (V85D, lokalisiert im Porenring des Kanals), die nach vorliegender Datenlage höchstwahrscheinlich zur Apoptose der Plasmazellen führt. Als Grund hierfür liegt die disruptierte Ca2+-Homöostase der Plasmazellen nahe, da Versuche in HeLa-Zellen, die der Übertragung des Phänotyps in ein manipulierbares Zellmodell dienten, einen konstitutiven Verlust an Ca2+ aus dem ER offenbarten. Letzterer kann in Plasmazellen, die zellphysiologisch als professionell sekretorische Zellen mit der Aufgabe der ER-Expansion konfrontiert sind, besonders schwer wiegen und deshalb spezifisch diesen Zelltyp in die Apoptose treiben. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der physiologischen Bedeutung des Sec61-vermittelten Ca2+-Leckstroms für die zelluläre ATP-Homöostase nachgegangen. Mit der Charakterisierung von SLC35B1 als ein ER-ständiges Protein, das in der Lage ist einen ATP/ADP-Austausch über Membranen zu vermitteln, wurde der Grundstein zum Vertändnis der Regulation der Energiehomöostase gelegt. Mit Hilfe biochemischer Methoden, die den ATP-Transport in vitro sowie der ATPER in vivo bestimmten und unter Zuhilfenahme von „Live Cell Calcium Imaging“, Transportversuchen mit BiP-abhängigen Substraten und der Bestimmung von AMPK-Leveln SLC35B1-depletierter HeLa-Zellen wurden verschiedene Eckpunkte der ERHomöostase als beteiligte Faktoren in der ATPER-Regulation charakterisiert. Daraus resultiert das Herzstück dieser Arbeit, nämlich ein Modell für die Regulation der Energiehomöostase des ER. Fällt die ATPER-Konzentration ab, von der zahlreiche intralumenale Proteine, darunter BiP abhängig sind, dissoziiert BiP von Sec61, das es unter homöostatischen Bedingungen gegen den Verlust an Ca2+ schützt. Ca2+, das folglich Sec61-vermittelt ins Cytosol gelangt, bindet an CaM und aktiviert die Ca2+-abhängige CaMKK2, die den zentralen Energiesensor AMPK phosphoryliert und damit aktivieren kann. Letzterer führt bei Energiemangelzuständen dazu, dass katabolische Wege zur ATP-Produktion angestoßen werden, wie die Glykolyse durch Phosphorylierung der PF2K. Daraufhin wird ATP vermehrt über SLC35B1 ins ER transportiert, wobei auch zusätzlich eine direkte Aktivierung von SLC35B1 durch Ca2+-CaM beteiligt sein kann. Sobald die ATP-Konzentration wieder homöostatische Level erreicht hat, bindet BiP wieder an Sec61 und limitiert so den Ca2+- Leckstrom und im Cytosol sorgt SERCA für die Rückführung von Ca2+ ins ER und PP2 für die Dephosphorylierung der aktivierten AMPK, wodurch der Signalweg inaktiviert wird.

Characterization of the physiological functions of the Sec61-associated Ca2+-leak Abstract Besides its well established role in protein translocation, reasearch of the last few years found that Sec61 also contributes significantly to the intracellular Ca2+ homeostasis. This is due to the Ca2+ permeability of the pore forming subunit Sec61α. Unanswered questions revolve around controlled channel dynamics and the physiological roles of the Sec61 mediated Ca2+ leak, which this thesis is dedicated to. In the first part, a PAD (primary antibody deficiency)-associated Sec61α mutation (V85D, localizes to the pore ring) was analyzed in order to find the underlying physiological mechanism of the pathology. Cell biological and biochemical approaches point towards an apoptotic switch in mutation carrying plasma cells as a consequence of disrupted Ca2+ homeostasis. The latter results from constitutive Sec61 mediated ER-Ca2+ leak which was shown by phenocopying the pathological situation in a HeLa cell model. The hypothesis derived from the experiments is based on the pronounced dependency of plasma cells as professionel secretory cells on a well regulated Ca2+ homeostasis because ER derived functions e.g. ER expansion is a prerequisite in their development. The second part of the work is dedicated to the physiological role of the Sec61 mediated ERCa2+ leak in cellular ATP homeostasis. Characterising SLC35B1 as a protein of the ERmembrane that is able to mediate an ATP/ADP exchange over membranes in ATP transport assays was key to further analyse a potential energy regulation route. Biochemical approaches with SLC35B1 depleted HeLa cells determining the Ca2+ homeostasis, in vitro transport of BiP-dependent precursor proteins and cytosolic AMPK levels identify the key players of a potential signaling pathway used to ensure ATPER supply. The resulting model states that in the regulation circuit decreasing ATPER leads to impaired BiP function which fails to seal Sec61 against the loss of ER-Ca2+. The increasing cytosolic Ca2+ is bound by CaM, which is an activating factor of CaMKK2, which again can phosphorylate and activate AMPK. Cytosolic AMPK is a central energy sensor, that activates catabolic pathways like glycolysis due to ATP deficiency. A potential glycolytic target of phosphorylated AMPK is PF2K, which is enhancing ATP-production and finally ATP is transported into the ER lumen via SLC35B1 residing in the ER membrane, which may additionally be activated by Ca2+-CaM binding to a cytosolic exposed IQ-motif. Having reached homeostatic ATPER levels the pathway secludes with BiP sealing Sec61α, the ATPase SERCA restoring low cytosolic Ca2+ levels and the dephosphorylation of AMPK by PP2.