Funktionale Analyse von Tötungsmechanismen humaner Melanom-spezifischer CD8+ T-Zellen und natürlicher Killerzellen

Abstract

Sowohl natürliche Killerzellen (NK-Zellen) als auch CD8+ T-Zellen (CTL) übernehmen als zytotoxische Effektorzellen komplementäre Aufgaben in der Immunantwort gegen Pathogene und entartete Zellen. NK-Zellen zählen zur angeborenen Immunität und erkennen ihre Zielzellen über die Bindung keimbahnkodierter Rezeptoren. CD8+ T-Zellen sind hingegen Teil der adaptiven Immunität und interagieren antigenspezifisch über ihren T-Zell-Rezeptor mit dem MHCI-Peptid-Komplex der Zielzelle. Um eine antigenspezifische Interaktion zwischen einer CD8+ T-Zelle und ihrer Zielzelle auch in vitro zu ermöglichen, wurde im Rahmen dieser Arbeit die Generierung antigenspezifischer CD8+ T-Zellklone erstmals in unserem Labor etabliert. Die Generierung Melanom-spezifischer CD8+ T-Zellklone (CTLMART1 und CTLgp100) hat die direkte Interaktion mit Melanomzellen ermöglicht, wodurch ein Melanom-Kokultur-Modell etabliert werden konnte. Dieses Kokultur Modell wurde im Rahmen dieser Arbeit eingesetzt, um die NK- und CD8+ T Zell Interdependenz (gegenseitige Abhängigkeit) besser verstehen zu können. Dabei wurde die SK-Mel5 Zelllinie zunächst dem Selektionsdruck durch NK bzw. CTLMART1 ausgesetzt. Die überlebenden Melanomzellen aus dieser Kokultur wurden anschließend in einem Zytotoxizitäts-Assay (Real-time Killing Assay) als Zielzellen von NK und CTLMART1 verwendet. Eine Erhöhung des NK:SK-Mel5 Verhältnisses in der Kokultur korrelierte dabei invers mit der Lyseeffizienz der kokultivierten Melanomzellen durch NK. Somit hatte eine NK-Kokultur eine Resistenz der überlebenden Melanomzellen gegen die NK-vermittelte Zytotoxizität zur Folge. Parallel wurde auch in den kokultivierten SK-Mel5 Zellen eine Hochregulation von MHCI, einem Liganden für NK-inhibitorische Rezeptoren, festgestellt. Im Gegenzug war die CTLMART1 vermittelte Zytotoxizität auf die NK-inkubierten SK Mel5 Zellen unverändert. Eine CTLMART1-Kokultur hatte überraschenderweise sowohl eine Resistenz der überlebenden SK-Mel5 Zellen gegen die NK- als auch CTLMART1-vermittelte Zytotoxizität zur Folge. Außerdem wurde auch hier die Expression der MHCI-Rezeptoren hoch-, jedoch ebenso die Expression des MART1 Proteins herunterreguliert. Durch extrazelluläre Beladung der CTLMART1-inkubierten SK Mel5 Zellen mit dem korrespondierenden MART1-Antigen konnte die Resistenz gegenüber der CTLMART1-vermittelten Zytotoxizität kompensiert werden. Die Herunterregulation der MART1-Proteinexpression bewirkt somit eine verminderte Präsentation des korrespondierenden MART1-Antigens über MHCI-Moleküle an der Plasmamembran (PM) und bedingt dadurch eine Reduktion der CTLMART1-vermittelten Zytotoxizität gegen CTLMART1-kokultivierte SK-Mel5 Zellen. Die CTL- und NK-Zell-vermittelte Zytotoxizität basiert in beiden Fällen auf den gleichen Mechanismen: Das Perforin-vermittelte Killing über Sezernierung von lytischen Vesikeln sowie die Bindung spezifischer Todes-Rezeptoren. Dabei kann der Zielzelltod durch Induktion der Apoptose, bei der die Integrität der PM erhalten bleibt, und durch Induktion der Nekrose ,die ein Aufplatzen der Zelle und damit den Verlust der PM-Integrität zur Folge hat, herbeigeführt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Eignung der beiden Apoptose-Sensoren pCasper3 GR sowie Annexin V in bildgebenden Verfahren zur Charakterisierung des Effektor-induzierten Zelltodes untersucht und miteinander verglichen. Der FRET-basierte Sensor pCasper3-GR indiziert mittels Farbumschlag der Zelle von orange nach grün die Aktivierung der Effektor-Caspase 3, während das Fluorophor-gekoppelte Annexin V die extrazellulär translozierten Phosphatidylserine (PS) an der PM bindet. Das apoptotische Sterben von Zielzellen wurde dabei stets signifikant früher durch Analyse des pCasper Signals als durch Verwendung von Annexin V detektiert. Interessanterweise wurden Nekrosen durch beide Sensoren nahezu gleichzeitig nachgewiesen. Das deutet darauf hin, dass Annexin V bei Nekrosen und Sekundärnekrosen (Verlust der Membranintegrität einer bereits apoptotischen Zelle) in die Zelle diffundiert und intrazellulär PS bindet, was es für die genaue Charakterisierung des Effektor-induzierten Zelltodes ungeeignet macht. Im Rahmen dieser Arbeit wurde mit der Generierung antigenspezifischer CD8+ T-Zellklone ein wertvolles Werkzeug in der AG Hoth etabliert, das die Analyse der CD8+ T-Zell-vermittelten Zytotoxizität in vitro in einem physiologischen Kontext, wie z. B. der Melanom-Kokultur, ermöglicht. Mit Hilfe des etablierten Kokultur-Modells kann die Charakterisierung der Resistenzmechanismen von Tumorzellen, die vor allen Dingen bei Immuntherapien von Krebspatienten eine Rolle spielen, untersucht werden. Außerdem kann ein besseres Verständnis der CD8+-NK-Zell-Interdependenz langfristig eine Optimierung von zellbasierten Immuntherapien zur Folge haben. Zudem ermöglicht der Vergleich verschiedener Zelltod-Sensoren eine verbesserte Analyse zytotoxischer Mechanismen und trägt so zu einem besseren Verständnis der Funktion von zytotoxischen Immunzellen bei.

Natural killer (NK) cells as well as CD8+ T cells (CTL) act as cytotoxic effector cells and perform complementary roles in immune responses against pathogens and malignant cells. NK cells belong to the innate immunity and express germ-line encoded activating and inhibitory receptors. CTL on the other hand are part of the adaptive immune system and recognize their targets by antigen-specific interactions of their T cell receptors (TCR) with MHCI-peptide-complexes presented by target cells. In this thesis, antigen-specific CD8+ T cell clones were generated for the first time in our laboratory to allow antigen-specific interactions between CD8+ T cells with their cognate target antigen in vitro. Generation of melanoma specific CD8+ T cell clones (CTLMART1 and CTLgp100) gave us the opportunity to analyze combined CTL- and NK-mediated cytotoxicity against human melanoma cells (SK-Mel5). To this end, a melanoma-coculture-model has been established. Firstly, SK-Mel5 cells were coincubated together with NK cells or CTLMART1, respectively. Surviving melanoma cells served as target cells and were challenged again by adding NK cells or CTLMART1 as effector cells in a cytotoxicity assay (real-time killing assay). An increase of the NK:SK Mel5-ratio in coculture correlated with a reduced NK-mediated cytotoxicity and thus an NK cell resistance of surviving melanoma cells. Simultaneously, MHC class I (MHCI), a ligand for inhibitory NK receptors, was upregulated by NK-cocultured SK-Mel5 cells. In contrast, CTLMART1-mediated cytotoxicity against melanoma cells was unaffected by NK-coincubation. Surprisingly, addition of CTLMART1 in SK-Mel5 coculture induced a resistance of surviving SK-Mel5 cells against NK- as well as CTLMART1-mediated cytotoxicity. A CTLMART1-coculture caused an upregulation of MHCI molecules in parallel to a decrease of MART1 expression. Exogenous administration of corresponding MART1-peptide in a rescue-experiment restored CTLMART1-mediated cytotoxicity against SK-Mel5 cells coincubated with CTLMART1 beforehand. Thus, downregulation of MART1-protein expression induces a reduced presentation of corresponding MART1-antigens via MHCI molecules at the plasma membrane (PM), thereby causing a reduction of CTLMART1-mediated cytotoxicity against CTLMART1-cocultured SK-Mel5 cells. CTL and NK cells are activated by different receptors but kill their target cells using the same basic mechanisms: perforin-mediated killing via secretion of lytic granules as well as binding of specific death receptors. Thereby different modes of cell death can be induced: apoptosis, which preserves PM integrity, and necrosis, which is indicated by disruption of the PM. In this thesis two different apoptosis sensors, pCasper3-GR and Annexin V, were tested in imaging based techniques to characterize effector cell-mediated cell death. The FRET-based pCasper3-GR sensor indicates activation of effector caspase 3 via color change from orange to green fluorescence emission. Fluorophore-labeled Annexin V on the other hand senses extracellular translocated phosphatidyl serines (PS) at the PM. In all experiments, pCasper signal analysis revealed apoptotic cell death before Annexin V signal analysis. Interestingly, analysis of both sensors revealed necrotic cell death almost simultaneously, indicating a diffusion of Annexin V into the cell, which causes an intracellular PS-binding. Thus, Annexin V seems to be an inappropriate marker for characterization of effector-induced cell death. By generating antigen-specific CD8+ T cell clones, a valuable tool has been established in our laboratory to study CTL-mediated cytotoxicity in vitro in a more physiological context. Using this tool, a melanoma-coculture-model could be established, which allows the characterization of resistance mechanisms used by tumor cells, having an impact on immune cell based tumor therapies of cancer patients. Furthermore, a better understanding of CTL-NK-cell interdependence could give rise to optimization strategies of immune therapies. Moreover, a comparison of different cell death markers facilitates an optimized analysis of cytotoxtic mechanisms and thereby contributes to a better understanding of cytotoxic immune cell function.