Prognostische Wertigkeit der TNM-Klassifizierung nicht-kleinzelliger Lungenkarzinome und der miRNA-Expression im Plasma von Patienten mit nicht-kleinzelligem Lungenkarzinom

Abstract

In Deutschland ist das Lungenkarzinom bei Männern die zweithäufigste (13,9%) und bei Frauen die dritthäufigste (8,5%) Krebsneuerkrankung. Mit 80-85% stellt das nicht-kleinzellige Lungenkarzinom die Hauptform des Lungenkarzinoms dar. Die chirurgische Resektion des Tumors ist die Therapie der Wahl im Frühstadium und die multimodale Therapie im fortgeschrittenen Tumorstadium. Trotz der Fortschritte und der Weiterentwicklung der Therapie des nicht-kleinzelligen Lungenkarzinoms ist die tumorbedingte Sterblichkeit hoch, sodass die 5-Jahresüberlebensrate bei Männern nur 15% und bei Frauen nur 18% beträgt. Die TNM-Klassifizierung beschreibt die anatomische Ausbreitung des Tumors in Abhängigkeit von Tumorgröße, Lymphknotenbefall und Fernmetastasierung und bestimmt so Therapie und Prognose. Sie wird ständig weiterentwickelt, und die 8. Auflage ist seit 01.01.2017 gültig. In der vorliegenden Studie wird die TNM-Klassifizierung der 8. Auflage der Union for International Cancer Control (UICC) dargestellt und mit der 7. Auflage in Bezug auf die prognostische Aussagekraft verglichen. Dies geschieht anhand einer eigenen Patientenpopulation. Weitere potenzielle prognostische Faktoren wie Geschlecht, Histologie, Resektionsverfahren und Resektionsstatus werden untersucht, desweite-ren die Bedeutung einer N1- und N2-Subklassifizierung. Die Liquid Biopsy stellt eine Methode zur genetischen Frühdiagnose des nicht-kleinzelligen Lungen-karzinoms dar. Sie ermöglicht die Untersuchung von Tumorzellen, DNA, und miRNA des Tumors. Micro-RNAs sind kleinkettige, nichtkodierende Ribonukleinsäuremoleküle, die die Expression ver-schiedener Onkogene oder Tumorsuppressorgene regulieren können. In der vorliegenden Studie wurden die miRNA-Profile in zwei Patientengruppen mit nicht-kleinzelligem Lungenkarzinom, die entweder eine lange postoperative Überlebenszeit (long time survivors, LTS) oder eine kurze postoperative Überlebenszeit hatten (short time survivors, STS), mit-tels Microarray-Technik analysiert. Desweiteren wurden fünf miRNAs (hsa-miR-142-3p, hsa-miR-26a-5p, hsa-miR-126-3p, hsa-let-7f-5p, und hsa-miR-574-5p) mittels Reverse Transkriptase – quanti-tative Echtzeit Polymerasekettenreaktion (RT-qPCR) quantifiziert und werden als prognostische Bi-omarker für das postoperative Überleben diskutiert. Es wurden von Juni 1998 bis Dezember 2011 operierte Patienten mit Lungenkarzinom eingeschlos-sen, von denen Plasmaproben vorhanden und deren Proben fünf Jahre oder älter sind. Überlebenszei-ten und Todesursachen wurden eruiert. Alle Daten wurden statistisch analysiert. Insgesamt wurden 430 Patienten in die Studie eingeschlossen. Die Anzahl der gesamten Sterbefälle beträgt 315 (73,3% aller untersuchten Patienten). Die 5-Jahresüberlebensraten unterscheiden sich statistisch nicht in Abhängigkeit vom Geschlecht (45,0% Frauen vs. 36,5% Männer) (p > 0,05), dar-über hinaus sind die tumorbedingten postoperativen Sterblichkeitsraten bei Männern und Frauen gleich (58,2% vs. 60,5%), die mittleren Überlebenszeiten sind jedoch bei tumorbedingt verstorbenen Frauen länger (35,5 Monate vs. 24,5 Monate) (p < 0,05). Die 5-Jahresüberlebensraten in Abhängigkeit von der Histologie sind 41,0% beim Adenokarzinom und 37,4% beim Plattenepithelkarzinom (p > 0,05), und die tumorbedingte postoperative Sterblichkeit ist 42,7% beim Adenokarzinom und 45,1% beim Plattenepithelkarzinom, d.h. die Histologieformen (Adenokarzinom vs. Plattenepithelkarzinom) spielen keine wesentliche Rolle für die postoperative Überlebenszeit und die Mortalität. Bezüglich der Resektionsverfahren sind die 5-Jahresüberlebensraten nach Lobektomie (41,7%) und nach Lobektomie mit Bronchusmanschettenresektion (34,8%) höher als nach Pneumonektomie (21,2%) (p < 0,05), auch die tumorbedingte postoperative Sterblichkeit ist nach Pneumonektomie mit 77,8% höher als nach Lobektomie und Lobektomie mit Manschettenresektion (p < 0,05), die eine ähnliche Mortalität (57,1% bzw. 57,5%) haben. Dies zeigt, dass die Lobektomie mit Bronchusman-schettenresektion weiterhin ein gutes alternatives chirurgisches Verfahren für die Pneumonektomie darstellt. Die Patienten mit makroskopisch tumorinfiltrierten Resektionsrändern (R2-Status) haben niedrige 5-Jahresüberlebensraten (25,8%) sowohl im Vergleich mit Patienten mit tumorfreien (R0-Status) als auch im Vergleich mit Patienten mit mikroskopisch tumorinfiltrierten Resektionsrändern (R1-Status) (41,3% bzw. 40,0%) (p < 0,05). Die 5-Jahresüberlebensraten sind höher bei Patienten mit N0-Lymphknotenstatus (48,9%) im Ver-gleich zu N1-Status (32,5%) und N2-Status (14,9%) (P < 0,001). Die Patienten mit N2-Status haben eine höhere tumorbedingte postoperative Sterblichkeit (78,9%) im Vergleich mit Patienten mit N0-Status und N1-Status (50,8% bzw. 64,3%) (p < 0,05). Nach Lymphknotensubklassifizierung des N1-Status und N2-Status zeigt sich trotz kleiner Patienten-gruppen ein Unterschied in den 5-Jahresüberlebensraten, sie sind bei single level-N1 (N1a) 37,9%, bei multilevel-N1 (N1b) 20,0%, bei single level-N2 (N2a) 10,3% und bei multilevel-N2 (N2b) 25,0% (p < 0,001), die medianen Überlebenszeiten bei single level N1-Status sind länger im Vergleich zu multilevel N1 (35 Monate vs. 25 Monate), ähnliches gilt für single level N2-Status und multilevel N2-Status (16 Monate vs. 12 Monate) (p < 0,001). Dies zeigt, dass eine Revision der Lymphknoten-klassifizierung in der kommenden TNM-Klassifizierung erforderlich sein wird. Die Analyse der UICC7- und UICC8-Klassifizierung der TNM-Stadien in der vorliegenden Studie zeigt, dass die Unterschiede zwischen gleichen Tumorstadien der UICC7- und UICC8-Einteilung hauptsächlich in Tumorstadium IIA und in IIIA liegen und die 8. Auflage homogenere Gruppen ent-hält.

Insgesamt wurden 2549 miRNAs mittels Microarray untersucht. Die statistische Analyse zeigt, dass die Expression von 52 miRNAs (2,0%) signifikant unterschiedlich in der LTS-Gruppe gegenüber der STS-Gruppe ist (p < 0,05). Die Validierung von fünf ausgewählten miRNAs (hsa-miR-142-3p, hsa-miR-26a-5p, hsa-miR-126-3p, hsa-let-7f-5p und hsa-miR-574-5p) mittels Reverse Transkription – quantitative Echtzeit Polymerasekettenreaktion (RT-qPCR) zeigt die fünf miRNAs in der STS-Gruppe im Vergleich mit der LTS-Gruppe unterexprimiert. Mit Hilfe von DIANA-miRPath v.3.0 Software konnten 57 KEGG-Signalwege identifiziert werden. Non-small cell lung cancer (hsa05223) ist der wichtigste Signalweg beim nicht-kleinzelligen Lungenkarzinom, er wird von hsa-miR-142-3p, hsa-miR-26a-5p, hsa-miR-126-3p, hsa-let-7f-5p reguliert. Die hsa-miR-574-5p ist in der vorliegenden Studie ebenfalls in der STS-Gruppe unterexprimiert, sie reguliert den genannten Signalweg nicht. Es wurden mehrere miRNA Zielgene in dem genannten Signalweg identifiziert, von ihnen acht Gene, die häufig beim nicht-kleinzelligen Lungenkarzinom mutiert sind (Treibermutationen). Als Onkogene sind es KRAS, EGFR, BRAF und EML4-ALK und als Tumorsuppressorgene RARβ, FHIT, INK4a/ARF und p53. Über diese Mutationen gibt es bereits medikamentöse Therapieansätze.

Lung cancer is in Germany the second most common cancer type in males (13.9%) and the third one in females (8.5%). Non-small cell lung cancer (NSCLC) represents about 80-85% of all lung cancer cases. Surgical resection is the therapy of choice in the early stages of the disease, whereas a multimodal strat-egy is applied in advanced stages. Though significant progress in the therapeutic approaches of NSCLC has been achieved, the tumor-related mortality remains high resulting in five-year survival rates of about 15% in males and 18% in females. The TNM-Classification describes the anatomical spread of the tumor in relation to tumor size, lymph node involvement and presence of metastases. In this manner, the TNM classification guides the thera-peutic strategies and determines the prognosis of the disease. The classification is constantly evolving and the 8th edition is available since 01.01.2017. In our study, the 8th edition of the UICC TNM-classification has been used; moreover a comparison to the 7th edition concerning the overall prognosis has also been made. This has been performed on the basis of a selected patient population. Potential prognostic factors such as gender, histology, resection mode and resection margins, as well as the im-portance of N1- and N2-subclassification have been examined. Liquid biopsy represents a useful method for the early diagnosis of NSCLC, enabling the examination of tumor cells and the respective DNA and miRNA. Micro-RNAs are small non-coding RNA mole-cules that regulate the expression of various oncogenes or tumorsuppressor genes. In our study, we analyzed the miRNA-profile of two patient-groups with NSCLC using microarray technique. The first group included patients with long postoperative survival (long time survivors, LTS) and the second group patients with a short postoperative survival (short time survivors, STS). Additionally, we quantified five different miRNAs using Reverse transcription-quantitative real time polymerase chain reaction (RT-qPCR) to determine their use as prognostic biomarkers for postopera-tive survival. The study included patients with NSCLC operated from June 1998 until December 2011. Plasma sam-ples obtained from these patients were at least 5 years old. A statistical analysis of all data, including survival and cause of death, was performed. A total of 430 patients were included in the study. The number of cases of death was 315, accounting for 73.3% of all cases. The 5-year survival rate did not differ statistically between males (36,5%) and females (45,0%), furthermore the tumor-related postoperative mortality rates of males (58,2%) and females (60,5%) were equal. The mean survival time of tumor-related deceased females (35,5%) was longer as that of males (24,5%) (p < 0,05). The 5-year survival was 41,0% for patients with adenocarcinomas and 37.4% for patients with squa-mous cell carcinomas (p > 0,05). The tumor-related postoperative mortality was 42.7% for adenocar-cionma and 45.1% for squamous cell carcinoma. These data imply that histology does not significantly influence postoperative survival and mortality. Regarding the resection procedure, 5-year survival rates of 41.7% after lobectomy and 34.8% after lo-bectomy with bronchial sleeve resection were noted, which were significantly higher as the 21.2% sur-vival rate after pneumonectomy (p < 0,05). The tumor-related mortality after pneumonectomy was also significantly higher as the mortality rates of the other two procedures, showing that a sleeve resection is more preferable to a pneumonectomy. Patients with a macroscopically incomplete resection of the tumor (R2) had a lower 5-year survival rate (25,8%) in comparison to patients with complete resection (R0) or microscopic incomplete resection (R1) (41,3% and 40,0% respectively) (p < 0,05). Five-year survival rates were higher in patients without lymph node involvement (N0) (48.9%) in com-parison to N1 (32.5%) or N2 (14.9%) status (p < 0.001). Patients with N2-status had a significantly higher tumor-related postoperative mortality (78.9%) as those with N0 (50.8%) and N1 status (64.3%) (p < 0.05). Further analysis of groups of patients according to a lymph node sub-classification could demonstrate statistically important differences between the various subgroups, despite smaller patient numbers. Five-year survival rate in N1 single level-subgroup (N1a) was 37.9%, in N1 multilevel-subgroup (N1b) 20%, in N2 single level-subgroup (N2a) 10.3% and in N2 multilevel-subgroup (N2b) 25% (p < 0.001) The median survival-time in single level N1 lymph node status was longer as in multilevel N1 (35 months vs 25 months); likewise survival rate in single level N2 status was longer as in multilevel N2 (16 months vs 12 months). All this implies that a revision of the lymph node classification in the com-ing TNM-edition would probably be reasonable. The analysis of the UICC7- and 8- classification of the TNM-staging in the present study showed that the differences between these two editions were mainly observed in tumor stages IIA and IIIA; moreo-ver the 8th edition contained more homogenous groups. A total of 2549 miRNAs were studied using microarray. The statistical analysis showed that the expres-sion of 52 miRNAs (2.0%) was significantly different in the LTS-group compared with the STS-group (p < 0.05). The validation of five selected miRNAs using RT-qPCR (hsa-miR-142-3p, hsa-miR-26a-5p, hsa-miR-126-3p, hsa-let-7f-5p and has-miR-574-5p) showed that the five miRNAs in the STS-group were under-expressed in comparison to the LTS-group. With the help of DIANA-miRPath v.3.0 Soft-ware, 57 KEGG-signal pathways were identified. Non-small cell lung cancer (hsa05223) is the most important pathway in NSCLC and is regulated by hsa-miR-142-3p, hsa-miR-26a-5p, hsa-miR-126-3p, hsa-let-7f-5p, but not by has-miR-574-5p. Several miRNA target-genes were identified in this specific pathway; eight of them are often mutated in NSCLC (driver-mutations): oncogenes KRAS, EGFR, BRAF, and EML4-ALK, and tumor-suppressor genes RARβ, FHIT, INK4a/ARF, and p53. Several thera-peutic approaches already exist for such mutations.