Die Auswirkungen spezifischer Mitofusin-2-Mutationen auf die mitochondriale Energetik und die Entwicklung von Herzinsuffizienz

Abstract

Die mitochondriale Calcium (Ca2+) -Aufnahme stimuliert die Schlüsselenzyme des Citratzyklus, infolgedessen NADH und FADH2 für die Produktion des Energieträgers ATP sowie NAD(P)H zum Schutz der Zelle vor reaktiven Sauerstoffspezies (engl.: Reactive Oxygen Species, ROS) bereitgestellt werden. Im Sinne einer Ca2+-Mikrodomäne wird eine enge räumliche Beziehung zwischen sarkoplasmatischem Retikulum (SR) und Mitochondrien hergestellt, welche die effiziente Ca2+-Aufnahme in die mitochondriale Matrix trotz der geringen Affinität des mitochondrialen Ca2+-Uniporter (MCU) erklären könnte. Das Fusionsprotein Mitofusin-2 (Mfn2) stellt eine wichtige Strukturkomponente dieser Ca2+- Mikrodomäne dar, Defekte durch spezifische Mfn2-Mutationen könnten die Ca2+- Kommunikation zwischen SR und Mitochondrien beeinträchtigen und zur Entwicklung einer Herzinsuffizienz beitragen. Um die Folge solcher Mfn2-Mutationen auf die mitochondriale Energetik und die Entwicklung der Herzinsuffizienz zu untersuchen, haben wir Herzmuskellen von Mäusen mit kardiomyozytenspezifischer Expression entweder des Wildtyp Mfn2 (TG-WT) bzw. einer mutierten Variante des Mfn2 (TG-R400Q) isoliert und mit ihren jeweiligen nicht-transgenen Geschwistertieren (nTG) verglichen. Die Mutation R400Q trat in Vorarbeiten unseres Kooperationspartners, Gerald W. Dorn II., gehäuft bei Patienten mit kardialer Hypertrophie auf. Wir verfolgten also das Ziel, zu untersuchen, ob diese Mutation des Mfn2 einen Einfluss auf die mitochondriale Energetik in Herzmuskelzellen hat. In einem elektrischen Feld wurden die isolierten Kardiomyozyten zunächst mit einer Frequenz von 0,5 Hz stimuliert, ehe eine Arbeitslasterhöhung für 180 s bei 5 Hz Stimulation mit Exposition an den β-adrenergen Agonisten Isoprenalin simuliert wurde. Beim anschließenden Auswaschen (engl.: Washout, WO) wurde Isoprenalin ausgespült und die Stimulationsfrequenz wieder auf 0,5 Hz reduziert. Mithilfe des IonOptix-Systems wurde die Sarkomerverkürzung der Kardiomyozyten aufgenommen, parallel ermöglichte die Anregung der Redoxäquivalente bei spezifischen Wellenlängen (λ) die Erfassung der Autofluoreszenzen von NADH bzw. NADPH sowie FAD. Separate Messungen mit dem oxidationssensitiven Farbstoff DCF ermöglichten die Detektion von ROS. Die Untersuchungen der kontraktilen Parameter für die Zellen von Mäusen, die das WT Mfn2 überexprimierten (TG-WT), ergaben keinen Unterschied zu den nicht-transgenen Kontrolltieren. Da in den Untersuchungen der Zellverkürzung keine signifikanten Unterschiede der TG-R400Q-Kardiomyozyten zu ihren nTG-Geschwistertieren als auch zur TG-WT-Gruppe auftraten (mit der Ausnahme eines signifikanten Unterschiedes in der fraktionellen Sarkomerverkürzung (FS) zwischen TG-R400Q- und nTG-Zellreihe), schlussfolgern wir, dass weder die Überexpression noch die Mutation des Mfn2 einen Einfluss auf die Kontraktilität haben. In den simultan durchgeführten Redoxmessungen weisen weder TG-R400Q- noch TG-WT- Kardiomyozyten einen Unterschied zu ihren Kontrolltieren auf. Im Vergleich der TG-R400Q- und TG-WT-Zellen miteinander zeigen TGWT- Kardiomyozyten eine signifikant verminderte Bereitstellung des Reduktionsäquivalents FADH2, weshalb wir eine eingeschränkte bioenergetische Adaptation als auch mitochondriale Ca2+-Aufnahme für diese Zellreihe schlussfolgern. In den Farbstoffmessungen zeigen sich zwischen TG-WT- und TG-R400Q-Zellen als auch zu ihren jeweiligen nTGGeschwistertieren keine signifikanten Unterschiede, weshalb wir eine Mehrbelastung der Kardiomyozyten durch ROS ausschließen können.

The impact of specific Mitofusin-2-mututations on mitochondrial energetics and the development of heart failure Mitochondrial calcium (Ca2+) uptake stimulates the key enzymes of the Krebs cycle, thus providing NADH and FADH2 for the production of the energy carrier ATP as well as NAD(P)H for the protection of the cell from reactive oxygen species (ROS). In the sense of a Ca2+ microdomain, a close spatial relationship is established between sarcoplasmic reticulum (SR) and mitochondria, which might explain efficient Ca2+ uptake into the mitochondrial matrix, despite the low affinity of the mitochondrial Ca2+ uniporter (MCU). The fusion protein mitofusin-2 (Mfn2) is an important structural component of this Ca2+ microdomain, and defects caused by specific Mfn2 mutations could interfere with Ca2+ communication between SR and mitochondria and contribute to the development of heart failure. To investigate the consequences of such Mfn2 mutations on mitochondrial energetics and the development of heart failure, we have isolated cardiac myocytes from mice with cardiomyocyte-specific expression of either wild type Mfn2 (TG-WT) or a mutated variant of Mfn2 (TG-R400Q) and compared with their respective non-transgenic sibling animals (nTG). The R400Q mutation was frequently found in patients with cardiac hypertrophy in preliminary work by our cooperation partner, Gerald W. Dorn II. Thus, we aimed to investigate whether this mutation of Mfn2 has an effect on mitochondrial energetics in cardiomyocytes. In an electric field, the isolated cardiomyocytes were first stimulated at a frequency of 0.5 Hz before a load increase for 180 s at 5 Hz stimulation with exposure to the β-adrenergic agonist isoprenaline was simulated. In the subsequent washout (WO), isoprenaline was rinsed out and the stimulation frequency was reduced again to 0.5 Hz. With the help of the IonOptix system, the shortening of the cardiomyocytes was recorded. In parallel, excitation of the redox equivalents at specific wavelengths (λ) enabled the detection of autofluorescence of NADH or NADPH as well as FAD. Separate measurements with the oxidation-sensitive dye DCF enabled the detection of ROS. Investigations of contractile parameters for the cells of mice overexpressing WT Mfn2 (TG-WT) revealed no difference to non-transgenic control animals. Since there were no significant differences between the TGR400Q cardiomyocytes and their nTG siblings as well as the TG-WT group in the cell shortening studies (except for a significant difference in fractional sarcomere shortening (FS) between TG-R400Q- and nTG-cells), we conclude that neither overexpression nor mutation of Mfn2 has any influence on contractility. In the redox measurements performed simultaneously, neither TG-R400Q nor TG-WT cardiomyocytes differed from their control animals. In comparison of the TG-R400Q and TG-WT cells, TG-WT cardiomyocytes show a significantly reduced provision of the reduction equivalent FADH2, which is why we conclude a limited bioenergetic adaptation as well as mitochondrial Ca2+ uptake for this cell line. In the dye measurements, there are no significant differences between TG-WT and TGR400Q cells as well as their respective nTG sibling animals, which is why we can exclude an additional burden of cardiomyocytes by ROS.