Please use this identifier to cite or link to this item: doi:10.22028/D291-30224
Title: Die Rolle von Cardiolipin in Bezug auf die elektro-mechanische Kopplung und mitochondriale Energetik am Beispiel des Barth Syndroms
Author(s): Krug, Carolin
Language: German
Year of Publication: 2020
Place of publication: Homburg/Saar
SWD key words: Herzinsuffizienz
Erbkrankheit
Free key words: Tafazzin
mitochondriale Dysfunktion
DDC notations: 500 Science
610 Medicine and health
Publikation type: Doctoral Thesis
Abstract: Das Herz hat einen enorm hohen Energiebedarf, und Mitochondrien sind der Hauptort für die Energieproduktion in Herzmuskelzellen (Kardiomyozyten). In Mitochondrien werden im Citratzyklus NADH und FADH2 produziert, welche an den Komplexen I und II der Atmungskette Elektronen abgeben, deren Transfer entlang der Atmungskettenkomplexe I-IV einen Protonengradienten produziert, welcher die Treibkraft für ATP-Produktion an der F1Fo-ATP-Synthase darstellt. Um die ATP-Produktion an den ständig variierenden Bedarf anzupassen, regulieren ADP und Ca2+ den Elektronenfluss entlang der Atmungskette. ADP aktiviert die F1Fo-ATP-Synthase, was den Elektronenfluss beschleunigt und NADH und FADH2 zu NAD+ und FAD oxidiert. Ein Anstieg der Arbeitslast wird unter physiologischen Bedingungen durch β-adrenerge Stimulation induziert, wodurch die Amplitude und Frequenz cytosolischer Ca2+-Transienten in Kardiomyozyten zunimmt. Ca2+ wird hierbei über den mitochondrialen Ca2+-Uniporter (MCU) in Mitochondrien aufgenommen, wo es Dehydrogenasen des Citratzyklus stimuliert. Hierdurch wird der Redoxstatus von NADH/NAD+ und FADH2/FAD wieder reduziert. NADH steht über die mitochondriale Transhydrogenase mit NADPH im Gleichgewicht, und NADPH ist für die Entgiftung von H2O2 essentiell. Somit kommt der mitochondrialen Ca2+-Aufnahme eine wichtige Rolle für die energetische Adaptation und die Regeneration der anti-oxidativen Kapazität zu. Bei verschiedenen Formen der Herzinsuffizienz wurde eine mitochondriale Dysfunktion mit energetischem Defizit und oxidativem Stress beobachtet. Seltene Ursachen einer Herzinsuffizienz sind genetische Mutationen. Eine solche Form der Kardiomyopathie findet sich beim Barth Syndrom, einer X-chromosomal rezessiven Erkrankung, die nur Jungen betrifft und neben einer Herzinsuffizienz auch eine skelettmuskuläre Myopathie und Immundefekte hervorruft. Der genetische Defekt betrifft das Gen (Taz), welches Tafazzin (TAZ) enkodiert. TAZ ist eine Transacylase, die für den letzten Schritt der Biosynthese von Cardiolipin benötigt wird, einem Phospholipid, welches insbesondere in der inneren mitochondrialen Membran vorkommt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Mechanismen für die Entstehung von oxidativem Stress in Mäusen mit Tafazzin-Knockdown (Taz-KD) genauer zu untersuchen, da diesem eine wichtige Rolle sowohl für die Pathophysiologie kardialer Erkrankungen als auch beim Barth Syndrom zugeschrieben wird. Insbesondere legten wir unser Augenmerk dabei auf eine möglicherweise gestörte mitochondriale Ca2+-Transmission, welche in einen Redox-Shift münden könnte. Um dieses Ziel zu erreichen, erfolgten Experimente an isolierten Kardiomyozyten und Mitochondrien von Taz-KD und Wildtyp (WT) Kontroll-Mäusen. Isolierte Kardiomyozyten wurden hinsichtlich ihrer Kontraktilität sowie ihres Redoxstatus anhand der Bestimmung von NADH, NADPH und FAD untersucht. Des Weiteren wurden die cytosolische Ca2+-Konzentration und die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) detektiert. Es zeigte sich dabei, dass die Taz-KD Kardiomyozyten, vor allem unter Arbeitslast, über eine geringere diastolische Länge verfügen, was eine diastolische Dysfunktion anzeigt. Eine systolische Dysfunktion war nicht zu verzeichnen. Im Hinblick auf den Redoxstatus konnten wir nachweisen, dass Taz-KD Kardiomyozyten im Experimentverlauf, insbesondere während der erhöhten Stimulationsfrequenz, eine signifikant stärkere Oxidation von NAD(P)H und FADH2 erfahren. Dies spricht für einen energetischen „Mismatch“, bei dem in Taz-KD Kardiomyozyten möglicherweise zu wenig NADH und FADH2 im Citratzyklus nachgebildet werden. Im Gegensatz zu WT Kardiomyozyten, in denen unter β-adrenerger Stimulation die cytosolischen Ca2+-Amplituden anstiegen, war dies in Taz-KD Kardiomyozyten nicht der Fall. Die Emission von H2O2 unterschied sich in beiden Gruppen, insbesondere in zusätzlichen Experimenten an isolierten Mitochondrien, trotz der vermehrten NADPH Oxidation nicht. In Zusammenschau der Ergebnisse schlussfolgerten wir, dass die Taz-KD Kardiomyozyten über eine diastolische Dysfunktion verfügen, die möglicherweise durch einen fehlenden Anstieg der mitochondrialen Ca2+-Konzentration unter Arbeitslasterhöhung bedingt ist. In der Tat konnten in weiterführenden Experimenten, die nicht durch mich selber ausgeführt wurden, ein ausgeprägter Defekt der mitochondrialen Ca2+-Aufnahme beobachtet werden, der auf eine starke Herabregulation des mitochondrialen Ca2+-Uniporters zurückzuführen war. Die fehlende mitochondriale Ca2+-Aufnahme erklärt das schwere Defizit der bioenergetischen Adaptation, indem sie zur ausgeprägten Oxidation von NAD(P)H und FADH2 während β-adrenerger Stimulation aufgrund einer fehlenden Aktivierung verschiedener Schlüsselenzyme des Citratzyklus führt. Somit erfolgt eine verminderte Regeneration von NAD(P)H, welches für die Elimination von H2O2 entscheidend ist. Vorhergehende Arbeiten, die den alleinigen Grund der ROS-Produktion in einer gestörten Funktion der Atmungskette aufgrund einer behinderten Superkomplex-Bildung durch aberrante Cardiolipinformen sahen, konnten somit widerlegt werden.
The heart has an enormous demand for energy. Mitochondria are the organelles of energy production within the heart muscle cells (cardiomyocytes). NADH and FADH2 are produced in mitochondria via the Krebs cycle, afterwards both molecules are oxidized by complex I and II of the mitochondrial respiratory chain. The transfer of those electrons along the respiratory chain complexes I-IV establishes a proton gradient, which serves as the driving force for ATP production via the F1F0-ATP-synthase. The demand of ATP production constantly varies, therefore the electron transfer of the respiratory chain is regulated by the intracellular ADP- and Ca2+ concentrations. ADP activates the F1Fo-ATP-synthase leading to the oxidation of NADH to NAD+ as well as FADH2 to FAD. Under physiological conditions, however, an increased ATP production is induced by β-adrenergic stimulation, which leads to an increased cytosolic Ca2+ level in cardiomyocytes. Subsequently, the mitochondrial Ca2+ uniporter (MCU) ensures the uptake of Ca2+ into mitochondria where it stimulates the dehydrogenases of the citric acid cycle. Thereby, NAD+ and FAD are reduced to NADH and FADH2 respectively. NADPH is essential for the detoxification of H2O2. Due to the equilibrium of NADH and NADPH, which is maintained by the mitochondrial transhydrogenase, the mitochondrial Ca2+ uptake mediates energetic adaptation as well as the regeneration of the oxidative capacity. In various forms of heart failure, mitochondrial dysfunction with energetic defects and oxidative stress have been observed. Genetic mutations are only rare causes for cardiac insufficiencies. One form of such a cardiomyopathy is the Barth syndrome, an X-chromosomal recessive inherited disease, which only affects men and also causes skeletal muscular myopathy or immune deficiencies. The genetic defect affects the TAZ gene, which encodes for Tafazzin (TAZ). TAZ is a transacylase, which is essential for the biosynthesis of cardiolipin, a phospholipid of the inner mitochondrial membrane. The aim of this thesis was to examine the mechanisms that lead to the development of oxidative stress in mice with Tafazzin knockdown (Taz-KD), as Taz-KD is supposed to play a key role with the pathophysiology of cardiac disorders as well as the Barth syndrome. Focus was put on a potentially disturbed mitochondrial Ca2+ transport, which may lead to a redox shift. Isolated mitochondria from cardiomyocytes of Taz-KD mice were compared to those of wild type (WT) mice. The isolated cardiomyocytes were examined with respect to contractility and redox state. Furthermore, the cytosolic Ca2+ concentration and the formation of reactive oxygen species (ROS) were detected. The results show a shorter diastolic sarcomere length in Taz-KD cardiomyocytes under an increased workload, which indicates a diastolic dysfunction. A systolic dysfunction could not be verified. Taz-KD cardiomyocytes show a significantly stronger oxidation of NAD(P)H and FADH2 over the course of the experiment, especially during times of increased stimulation frequencies. This indicates an energetic mismatch, where Taz-KD cardiomyocytes may provide a decreased amount of NADH and FADH2 in the citric acid cycle. In contrast to Taz-KD cardiomyocytes, a rising cytosolic Ca2+ concentration during β-adrenergic stimulation could only be shown for WT cardiomyocytes. Although isolated mitochondria showed increased NADPH oxidation, the emission of H2O2 did not differ between both groups. Based on the results, it can be concluded that Taz-KD cardiomyocytes have a diastolic dysfunction, and that during workload transitions, oxidation of pyridine nucleotides may be the result of decreased mitochondrial Ca2+ uptake. Consecutive experiments of our working group indeed identified a distinctive defect of mitochondrial Ca2+ uptake, which is caused by a strong downregulation of the mitochondrial Ca2+ uniporter. The lack of mitochondrial Ca2+ uptake therefore explains the strong deficiency of bioenergetic adaptation and leads to the oxidation of NAD(P)H and FADH2 during β-adrenergic stimulation due to inactive Ca2+ dependent key enzymes of the citric acid cycle, hence hindering the regeneration of NAD(P)H, which is crucial for the H2O2 elimination. These data argue against the currently prevailing concept that in Barth syndrome, mitochondrial ROS formation is the result of defects in the respiratory chain secondary to cardiolipin deficiency, but rather point towards defective mitochondrial Ca2+ uptake that hampers the adaptation of the antioxidative capacity during workload transitions.
Link to this record: urn:nbn:de:bsz:291--ds-302244
hdl:20.500.11880/28674
http://dx.doi.org/10.22028/D291-30224
Advisor: Maack, Christoph
Date of oral examination: 13-Jan-2020
Date of registration: 10-Feb-2020
Faculty: M - Medizinische Fakultät
Department: M - Innere Medizin
Professorship: M - Prof. Dr. Michael Böhm
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