Ca2+-Sensibilisierung der Myofilamente erhöht mitochondriale Wasserstoffperoxidemission in Herzmuskelzellen

Abstract

Hintergrund: Chronische Herzinsuffizienz ist ein klinisches Syndrom, bei dem neben einer permanenten sympathischen Aktivierung vor allem eine mehrdimensionale kardiomyozytäre Dysfunktion die Persistenz und Progression der Erkrankung bedingt. Während am Herzen eine Vielzahl von verschiedenen pathologischen Konditionen in einer Herzinsuffizienz münden und diese sich je nach Ätiologie in einer Herzinsuffizienz mit verminderter oder erhaltener Ejektionsfraktion manifestiert, verursachen auf ultrastruktureller Ebene pathognomonische Mechanismen ein energetisches Defizit, eine Störung der elektromechanischen Kopplung, eine Fehlregulation der Ionenhomöostase sowie oxidativen Stress. So führen beispielsweise beim Krankheitsbild der hypertrophen Kardiomyopathie genetische Mutationen zu einer myofilamentären Ca2+-Sensibilisierung, die durch eine Hyperkontraktilität einen exzessiven Energieverbrauch provoziert und infolgedessen homöostatische Zellfunktionen einschränkt. Auch hier scheinen reaktive Sauerstoffspezies (ROS) eine fundamentale Rolle in der Aufrechterhaltung und Verschärfung zellulärer Disbalancen zu spielen. Zielsetzung: Mithilfe der vorliegenden Forschungsarbeit sollte untersucht werden, ob membranpermeable Wasserstoffperoxidmoleküle für den bei einer pharmakologischen Ca2+-Sensibilisierung auftretenden erhöhten reaktiven Sauerstoffspezies-Anfall verantwortlich sind; und inwiefern eine vermehrte mitochondriale Wasserstoffperoxidelimination die mitochondriale Energetik sowie den zellulären Redoxstatus beeinflusst. Methoden und Ergebnisse: Mitochondrien und einzelne Kardiomyozyten wurden aus Herzen von jungen, adulten mCAT-Mäusen mit einer 50-fach erhöhten kardialen, mitochondrialen Katalaseaktivität isoliert und mitochondrialen bzw. zellulären Funktionsmessungen zugeführt. Hierbei konnten bei Atmungs-, Superoxid- und Wasserstoffperoxid-Messungen an isolierten Mitochondrien keine nennenswerten Diskrepanzen zwischen mCAT- und Wildtyp-Mäusen beobachtet werden. Das gleiche Resultat zeigte sich an isolierten Kardiomyozyten bei der Überprüfung des zellulären Redoxstatus. Dieser wurde mithilfe eines Epifluoreszenzmikroskops anhand der Autofluoreszenz von NAD(P)H und FAD in einem physiologischen Stressprotokoll bestimmt, in dem isolierte Herzmuskelzellen unter β-adrenerger Stimulation (30 nM Isoprenalin) 180 Sekunden bei 5 Hertz stimuliert wurden. Unter Verwendung des Fluoreszenzfarbstoffs 2',7'-Dichlorofluorescein (DCF) wurde bei gleicher Arbeitslast die kardiomyozytäre Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies ermittelt, die sich ebenfalls nicht zwischen beiden Versuchsgruppen unterschied. Im Gegensatz dazu zeigten die Wildtyp-Myozyten im Vergleich zu den mCAT-Myozyten hier bei exogener Zugabe von Wasserstoffperoxid (H2O2) eine stärkere Oxidation von DCF (p<0,0001). Des Weiteren führte der Einsatz des Calcium-Sensitizers EMD 57033 bei den Wildtyp-Mäusen im Vergleich zu ihrer Kontrollgruppe zu einer Zunahme der reaktiven Sauerstoffspezies-Konzentration (p<0,05). Dagegen konnten Myozyten von mCAT-Mäusen im Vergleich zu unter Kontrollbedingungen gemessenen WT-Myozyten den Anstieg der DCF-Fluoreszenz unterbinden (p<0,05) und auch unter dem Einfluss von EMD 57033 eine weitere Steigerung des DCF-Fluoreszenzsignals verhindern. Demzufolge war die mitochondriale ROS-Emission in Anwesenheit des Calcium-Sensitizers EMD 57033 durch die mitochondriale Katalase-Überexpression erheblich supprimiert. Dies legt nahe, dass H2O2 diejenige reaktive Sauerstoffspezies ist, die bei einer Ca2+-Sensibilisierung der Myofilamente eine Oxidation des DCF induziert. Schlussfolgerung: Während unter physiologischen zellulären Bedingungen die normale antioxidative Kapazität in kardialen Mitochondrien ausreicht, um herkömmliche Konzentration von reaktiven Sauerstoffspezies unschädlich zu machen, werden in Abhängigkeit des zellulären Redoxstatus die mitochondrialen Entgiftungssysteme bei oxidativem Stress überfordert. Eine pharmakologische Ca2+-Sensibilisierung der Myofilamente imitiert diesbezüglich eine pathophysiologische Situation, bei der durch einen höheren Energieverbrauch fokale Disbalancen entstehen, die eine vermehrte Produktion von Wasserstoffperoxid hervorrufen.

Background: Chronic heart failure is a clinical syndrome in which, besides an incessant sympathetic activation, especially a multidimensional malfunction of cardiomyocytes causes the disease’s insistence and progression. Whereas a plethora of different pathological heart conditions leads to heart failure and depending on etiology becomes manifest in either heart failure with reduced or preserved ejection fraction, pathognomonic mechanisms induce on an ultrastructural level an energetic mismatch, an impairment of excitation-contraction coupling, a dysregulation of ion homeostasis and oxidative stress. For instance, in hypertrophic cardiomyopathy, genetic mutations evoke a sensitization of myofilaments to Ca2+, which provokes via hypercontractility an excessive consumption of energy and, therefore, reduces homeostatic cell functions. In this respect, reactive oxygen species (ROS) appear to play a fundamental part in the maintenance and aggravation of cellular imbalances, too. Objective: The present research paper was intended to investigate, whether membrane-permeable hydrogen peroxide molecules are accountable for the arising accumulation of reactive oxygen species upon pharmacological Ca2+-sensitization; as well as to what extent an increased mitochondrial detoxification of hydrogen peroxide affects mitochondrial energetics and the cellular redox state. Methods and Results: Mitochondria and single cardiomyocytes were isolated from heart preparations of young, adult mCAT mice, which exhibit a 50-fold increase of catalase activity in cardiac mitochondria. Samples were then utilized in mitochondrial and cellular functional measurements, respectively. In isolated mitochondria, no noteworthy differences were detected between mCAT and wild-type mice measuring respiration plus superoxide formation and hydrogen peroxide production. An equal result was unfolded examining the cellular redox state in isolated cardiomyocytes. By use of an epifluorescence microscope and via the autofluorescence of NAD(P)H und FAD, it was determined within a physiological stress protocol in which cardiac myocytes were stimulated during β-adrenergic stimulation (30 nM Isoprenaline) for 180 seconds at 5 hertz. At identical work load, the cardiomyocytes’ emission of reactive oxygen species was detected using the fluorescent dye 2',7'-Dichlorofluorescein (DCF). The oxidation of DCF did not differ during the stress protocol. In contrast, wild-type myocytes displayed a larger accumulation of reactive oxygen species upon external addition of hydrogen peroxide (H2O2) in comparison to mCAT myocytes (p<0,0001). Furthermore, related to their control group, the application of the calcium sensitizer EMD 57033 led to an increased formation of reactive oxygen species in wild-type mice (p<0,05). However, in myocytes from mCAT mice, the increase in DCF fluorescence was blunted compared to wild-type myocytes under control conditions (p<0,05), and no further increase in DCF fluorescence was observed in response to EMD 57033. Accordingly, in the presence of EMD 57033, mitochondrial ROS emission was substantially suppressed by mitochondrial overexpression of catalase, indicating that H2O2 is the reactive oxygen species that induces DCF oxidation in response to myofilament Ca2+-sensitization. Conclusion: Whereas, under physiological cellular conditions, the antioxidative capacity of cardiac mitochondria is sufficient to eliminate conventional levels of reactive oxygen species, the mitochondrial detoxification systems are overwhelmed by oxidative stress, depending on the cellular redox state. Regarding this, a pharmacological Ca2+-sensitization of myofilaments imitates a pathophysiological situation in which focal energy imbalances are developed that cause an increased formation of hydrogen peroxide.