Role of the SNAP-25 linker domain in calcium-triggered exocytosis

Abstract

Spatially and temporally controlled release of neurotransmitters, hormones, and neuropeptides is crucial for proper regulation of physiological processes. On the molecular level, exocytosis of secretory vesicles is driven by assembly of tetra-helical complexes out of the Soluble N–ethylmaleimide sensitive factor (NSF) attachment protein receptor (SNARE) motifs of synaptosomal associated protein 25 (SNAP 25), syntaxin-1a (Stx), and synaptobrevin-2 (Syb). The formation of membrane-bridging trans-SNARE complexes putatively brings vesicle and plasma membrane into close apposition against repulsive forces, thereby allowing for subsequent membrane merger and establishment of a fusion pore. While the structure of the core of the SNARE complex has been resolved on the atomistic scale, the functional implications of several structural features of SNARE proteins have remained poorly understood. In particular, the mechanistic function of the bidentate organization of SNAP 25 is still largely obscure: While Stx and Syb represent transmembrane proteins that contain a single SNARE motif in their cytosolic domains (Qa and R; respectively), SNAP 25 comprises two SNARE motifs (Qb and Qc), which are connected by a 60 amino acid-long acylated linker peptide. In this work, we have investigated the role of this unique SNAP 25 linker domain, which is highly conserved among all orthologs in vertebrates. Earlier studies have considered the linker as a functionally dispensable connector, as it lacks a detectable secondary structure and is not required for SNARE-mediated liposome fusion in vitro. Addressing the idea of an inert linker, we have performed an elaborated structure-function analysis introducing linker mutants into SNAP 25 knock out chromaffin cells by means of a viral expression system. In particular, we tested whether SNAP 25 linker integrity is mechanistically important for secretion and found that co expression of two complementing SNAP 25 fragments (each containing an intact SNARE motif) only reestablished a severely diminished, kinetically distorted secretory response – thus indicating a mechanistic requirement for a continuous SNAP 25 backbone. Substitution of the whole linker by an artificial, flexible peptide that was only composed of glycine and serine residues led to a completely dysfunctional SNAP 25 variant, which even caused a slight dominant-negative effect on secretion when expressed in wild type (WT) chromaffin cells. Similarly, partial substitution mutants, in which only N- or C-terminal linker segments was replaced by a flexible G/S peptide, exhibited strong functional deficits in primed pool maintenance and fusion triggering. As linker substitution mutants exhibited a delayed kinetics of SNARE assembly in biochemical assays, some of the functional defects might arise from altered SNARE interactions due to a loss of interaction motifs and/or changed conformational properties of the linker. In support of this idea, we found that mutation of four bulky hydrophobic residues that were postulated to mediate the association of the C-terminal linker section with the core complex induced the key phenotypical traits of the larger C-terminal substitution mutant, albeit the overall phenotype was less severe. An incremental exacerbation of the functional deficits could be observed, when the last 9 amino acids of the C-terminal linker were replaced, supporting the view that C-terminal linker attachment to the core complex is essential for effective fusion. Mutations targeting the N-terminal palmitoylation motif also had a strong impact on secretion: substitution of the acylated cysteine residues tremendously slowed-down release and decreased the size of the readily-releasable pool. Interestingly, we could exclude the possibility that compromised secretion was indirectly caused by a mislocalization of non-acylated SNAP 25, as the main functional deficits persisted even after retargeting mutant SNAP 25 (cysteine deficient) back to the plasma membrane via a secondary, N-terminal palmitoylation-motif. To investigate whether the acyl anchors of the linker contribute to force transfer from the assembling core complex onto the plasma membrane, we generated mutants, in which SNARE motif and linker were mechanically uncoupled by insertion of flexible spacer peptides of different lengths. While these mutants exhibited a mild fusion triggering phenotype, as would be expected for ineffective molecular straining of the membrane, spacer insertion in palmitoylation-deficient SNAP 25 also exacerbated defective triggering, which clearly contradicts the idea of SNARE force transfer. Thus, spatially defined linker:membrane contacts near the prospective fusion site at C-terminal end of the core complex are of crucial importance the fusion mechanism, while the mechanical coupling of SNARE complex and linker palmitoylation motif seem negligible. In summary, our data uncover a mechanistic requirement for the SNAP 25 linker domain in fast Ca2+ triggered exocytosis. The SNAP 25 linker primarily serves to functions: [1] it promotes SNARE complex nucleation and assembly by engaging in core complex interactions. [2] It mediates mechanistically important membrane interactions that potentially establish a favorable bilayer configuration for membrane merger. Thus, the linker domain is not just a flexible connector of SNAP 25 SNARE motifs, but itself acts as a functional component of the fusion machinery.

Die räumlich und zeitlich kontrollierte Freisetzung von Neurotransmittern, Hormonen und Neuropeptiden ist entscheidend für die ordnungsgemäße Steuerung physiologischer Prozesse. Auf molekularer Ebene wird die Exozytose sekretorischer Vesikel durch den Zusammenbau von tetra-helicalen Komplexen aus den SNARE-Motiven von SNAP-25, Syntaxin-1a (Stx) und Synaptobrevin-2 (Syb) vorangetrieben. Die Bildung von Membran-verbrückenden trans-SNARE-Komplexen bringt Vesikel und Plasmamembran vermutlich gegen abstoßende Kräfte in enger Anordnung, wodurch eine anschließende Membranfusion und die Bildung einer Fusionspore ermöglicht werden. Während die Struktur des Kerns des SNARE-Komplexes auf atomarer Ebene aufgelöst wurde, sind die funktionalen Implikationen verschiedener Strukturmerkmale von SNARE-Proteinen bisher wenig bekannt. Insbesondere ist die mechanistische Funktion der zweizähnigen Organisation von SNAP-25 noch weitgehend unklar: Während Stx und Syb Transmembranproteine darstellen, die ein einzelnes SNARE-Motiv in ihren zytosolischen Domänen (Qa bzw. R;) enthalten, umfasst SNAP-25 zwei SNARE Motive (Qb und Qc), die durch ein 60 Aminosäuren langes acyliertes linkerpeptid verbunden sind. In dieser Arbeit haben wir die Rolle dieser einzigartigen SN25-linkerdomäne untersucht, die bei allen Orthologen in Wirbeltieren hoch konserviert ist. In früheren Studien wurde der linker als funktionsfähig verzichtbarer Konnektor betrachtet, da ihm eine nachweisbare Sekundärstruktur fehlt und er für die SNARE-vermittelte Liposomenfusion in vitro nicht erforderlich ist. Um die Idee eines inerten linkers anzusprechen, haben wir eine ausführliche Struktur-Funktions-Analyse durchgeführt, bei der linker-Mutanten mittels eines viralen Expressionssystems in SNAP-25- /- (KO) - Chromaffinzellen eingeführt werden. Wir untersuchten insbesondere, ob die linkerintegrität für die Sekretion mechanistisch wichtig ist, und stellten fest, dass die co-expression von zwei komplementären SN25-Fragmenten (die jeweils ein intaktes SNARE-Motiv enthalten) nur eine stark verminderte, kinetisch verzerrte sekretorische Reaktion wieder herstellte für ein durchgehendes SNAP-25-Backbone. Die Substitution des gesamten linkers durch ein künstliches, flexibles Peptid, das nur aus Glycin- und Serinresten bestand, führte zu einer vollständig dysfunktionellen SNAP25-Variante, die bei Expression in WT-Chromaffinzellen sogar einen geringfügig dominanten negativen Effekt auf die Sekretion auslöste. In ähnlicher Weise zeigten partielle Substitutionsmutanten, bei denen nur N- oder C-terminale linker-Segmente durch ein flexibles G / S-Peptid ersetzt wurden, starke funktionale Defizite bei der Aufrechterhaltung und Fusionsauslösung des Primed Pools. Da linker-Substitutionsmutanten in biochemischen Assays eine verzögerte Kinetik der SNARE-Assemblierung zeigten, könnten einige der Funktionsdefekte auf veränderte SNARE-Wechselwirkungen aufgrund eines Verlusts von Interaktionsmotiven und / oder geänderten Konformationseigenschaften des ZUSAMMENFASSUNG XIV linkers zurückzuführen sein. Zur Unterstützung dieser Idee haben wir herausgefunden, dass die Mutation von vier sperrigen hydrophoben Resten, die postuliert wurden, um die Assoziation des C-terminalen linker-Abschnitts mit dem Kernkomplex zu vermitteln, die phänotypischen Schlüsselmerkmale der größeren C-terminalen Substitutionsmutante induziert, wenn auch insgesamt Der Phänotyp war weniger schwerwiegend. Eine schrittweise Verschlimmerung der funktionellen Defizite konnte beobachtet werden, als die letzten 9 Aminosäuren des C-terminalen linkers ersetzt wurden. Dies unterstreicht die Ansicht, dass die Anbindung des C-terminalen linkers an den Kernkomplex für eine effektive Fusion unerlässlich ist. Mutationen, die auf das N-terminale Palmitoylierungsmotiv abzielten, hatten ebenfalls einen starken Einfluss auf die Sekretion: Die Substitution der acylierten Cysteinreste verlangsamte die Freisetzung enorm und verringerte die Größe des schnell freisetzbaren Pools. Interessanterweise konnten wir die Möglichkeit ausschließen, dass die beeinträchtigte Sekretion indirekt durch eine Fehllokalisierung von nicht acyliertem SNAP-25 verursacht wurde, da die Hauptfunktionsdefizite auch nach dem Retargeting von mutiertem SNAP-25 über eine sekundäre N-terminale Palmitoylierung zur Plasmamembran bestehen blieben -Motiv. Um zu untersuchen, ob die Acylanker des linkers zur Kraftübertragung vom Assemblierungskernkomplex auf die Plasmamembran beitragen, wurden Mutanten generiert, bei denen SNARE-Motiv und linker durch Einfügen von flexiblen Spacerpeptiden unterschiedlicher Länge mechanisch entkoppelt wurden. Während diese Mutanten einen milden fusionsauslösenden Phänotyp zeigten, wie dies bei einer ineffektiven molekularen Dehnung der Membran zu erwarten wäre, verstärkte die Spacer-Insertion in palmitoylationsdefizientem SNAP-25 auch das fehlerhafte Triggern, was der Idee der SNARE-Kraftübertragung eindeutig widerspricht. So ist räumlich definierter linker: Membrankontakte in der Nähe der voraussichtlichen Fusionsstelle am C-terminalen Ende des Kernkomplexes sind von entscheidender Bedeutung für den Fusionsmechanismus, während die mechanische Kopplung von SNARE-Komplex und linker-Palmitoylierungsmotiv vernachlässigbar erscheint. Zusammenfassend zeigen unsere Daten eine mechanistische Anforderung an die SN25-linkerdomäne bei schneller Ca2+-gesteuerter Exozytose. Der linker dient in erster Linie den Funktionen: [1] Er fördert die SNARE-Komplex-Nukleation und -Montage durch Einbindung in komplexe Interac-Interaktionen [2] Er vermittelt mechanistisch wichtige Membranwechselwirkungen, die möglicherweise eine günstige Doppelschichtkonfiguration für die Membranfusion ergeben. Die Linkerdomäne ist somit nicht nur ein flexibler Konnektor von SNAP-25-SNARE-Motiven, sondern fungiert selbst als funktionaler Bestandteil der Fusionsmaschinerie.