Please use this identifier to cite or link to this item: doi:10.22028/D291-29948
Title: Astrocyte-specific gene recombination in vivo : Tamoxifen-induced and -independent recombination
Author(s): Kasakow, Carmen Vanessa
Language: English
Year of Publication: 2018
Place of publication: Homburg/Saar
SWD key words: Astrozyt
Tamoxifen
DDC notations: 610 Medicine and health
Publikation type: Doctoral Thesis
Abstract: Astrocytes express a plethora of neurotransmitter receptors that form “microdomains” for signaling pathways along their processes. The purinergic P2Y1 receptor (P2Y1R) is involved in long-range intercellular signaling of astrocytes involving gliotransmitter release. In neuropathological situations, blocking of P2Y1R can provide neuroprotection against glutamatergic excitotoxicity as occurring in stroke models. To investigate and temporally control the expression of the main purinergic receptor P2Y1 in cortical astrocytes, we took advantage of GLAST-CreERT2 x P2Y1fl/fl receptor mice. For precise temporal control of gene recombination, we explored the pharmacokinetic properties of tamoxifen after intraperitoneal injections using mass spectrometry (HPLC-MS). In addition, successful astroglial recombination was determined by quantitative real time PCR (qRT-PCR) of genomic DNA and mRNA in conditional knockout (cKO) mice. Our HPLC-MS analysis showed a fast uptake of TAM and its most active metabolite 4-hydroxytamoxifen (4-OH-TAM) in the brain peaking already at eight hours post injection. The clearance of TAM and 4-OH-TAM was similarily fast. Both were almost completely excreted 48 hours after injection. The efficiency of TAM-induced recombination was also determined by qRT-PCR of genomic DNA purified from brain homogenates of cKO mice, and in addition, by quantifying reporter-positive cells in GLAST-CreERT2 x tdTomato mice, revealing the percentage of astrocytes among all neural cells. In the cortex 20 % of all cells were GLAST-positive, whereas in the cerebellum only 6 % account for astrocytes. The astroglial p2ry1 gene deletion resulted in mRNA reductions of 43 % in the cortex and 61 % in the cerebellum, revealing a high amount of astrocytic P2Y1R among all neural cells. MACS isolated astrocytes showed a higher percentage of receptor ablation compared to total brain homogenates but did not reach 100 % reduction. A reduction of about 60 % in the cortex and about 30 % in the cerebellum was detected, indicating that not all sorted cells were recombined. Next generation sequencing results revealed about 50 % reduction of P2Y1R mRNA in cKOs in cortex and cerebellum. To investigate the impact of P2Y1R under pathological conditions, we performed the stab wound injury model to cKO and control mice. Staining of the glial fibrillary acidic protein (GFAP) of coronal sections revealed no impact of the P2Y1R on lesion size and astrocytic activation. The characterization and comparison of spontaneous-evoked Ca2+ signals was performed in anesthetized and awake P2Y1R control and cKO mice. We demonstrated a burst of Ca2+ signals upon ATP application on control astrocytes with enhanced and shortened signals in gliapil and soma. In contrast, Ca2+ signals of the P2Y1R cKO were smaller and shorter compared to controls, reflecting the reduction of purinergic signaling in astrocytes. We observed changes in Ca2+ signaling in the gliapil of the cKO, indicating alterations of Ca2+ signals in astrocytic microdomains. Ca2+ signals were even shorter and smaller in awake mice, revealing the influence of anesthesia on astrocytic Ca2+ signaling. In summary, ablation of the P2Y1R could be demonstated at the molecular level. A functional analysis of cKO mice revealed changes in the in vivo Ca2+ signals, indicating an important role of this receptor for astrocytic function.
Astrozyten exprimieren eine Reihe von Neurotransmitter-Rezeptoren, die Mikrodomänen für die intrazelluläre Signaltransduktion entlang ihrer Fortsätze ausbilden. Der purinerge P2Y1-Rezeptor (P2Y1R) ist an raumgreifenden astrozytären Signalen beteiligt und schützt Neurone vor glutamaterger Überstimulation, wie sie bei Infarkten vorkommt. Zur Untersuchung und zeitlichen Kontrolle der P2Y1-Rezeptor-Expression, wurden Tamoxifen-induzierbare GLAST-CreERT2 x P2Y1fl/fl Mäuse verwendet. Für die präzise zeitliche Induktion der Genrekombination, wurden die pharmakokinetischen Eigenschaften von Tamoxifen nach einer intraperitonealen Injektion mittels Massenspektrometrie (HPLC-MS) ermittelt. Zusätzlich wurde die erfolgreiche astrogliale Rekombination mittels quantitativer Real-time PCR (qRT-PCR) mit genomische DNA und mRNA in konditionalen Knockout-Mäusen (cKO) ermittelt. Die HPLC-MS-Analyse zeigte eine schnelle Aufnahme von Tamoxifen und dessen Hauptmetabolit 4-Hydroxy-Tamoxifen (4-OH-TAM) in das Gehirn, mit erreichten Höchstwerten schon acht Stunden nach der Injektion. Ähnlich schnell sanken die Werte von TAM und 4-OH-TAM auch wieder und waren 48 h nach der Injektion kaum noch detektierbar. Die TAM-induzierte Rekombinationseffizienz wurde auch in Gehirnhomogenaten von cKOs durch qRT-PCR Analyse genomischer DNA ermittelt. Zudem wurden Reporter-positive Zellen in GLAST-CreERT2 x tdTomato Mäusen zur Quantifizierung des Astrozytenanteils im Vergleich zu allen anderen neuralen Zellen verwendet. Im Kortex wurden 20 % GLAST-positive Zellen (= Astrozyten) über qRT-PCR rekombinierter Allele sowie Auszählung Reporter-positiver Zellen ermittelt, wohingegen im Zerebellum nur 6 % Astrozyten detektiert werden konnten. Im cKO wurde die Reduktion der P2Y1R mRNA mittels qRT-PCR überprüft. In Kortex und Zerebellum resultierte die astrogliale Deletion des p2ry1 Gens in einer Reduktion der P2Y1R mRNA um 43 % in Kortex- und 61 % in Zerebellum-Homogenaten. In MACS isolierten Astrozyten konnte, im Vergleich zu den Gehirnhomogenaten, eine stärkere Deletion des Rezeptors nachgewiesen werden, jedoch wurde auch hier keine 100 %ige Reduktion erreicht. Auf DNA Ebene konnte eine Reduktion um 60 % im Kortex und 30 % im Zerebellum detektiert werden. Dies weist darauf hin, dass nicht alle isolierten Zellen rekombiniert waren. Next Generation Sequencing (NGS) Daten bestätigen für Kortex und Zerebellum eine Reduktion der P2Y1R mRNA in den cKOs (50 %). Der Einfluss des P2Y1R unter pathologischen Bedingungen wurde mittels einer akuten Verletzung (Stichverletzung) von cKOs und Kontrollen analysiert. Das Anfärben koronaler Hirnschnitte mit dem sauren Gliafaserprotein Marker (glial fibrillary acidic protein, GFAP) zeigte keinen Einfluss des P2Y1R auf die Läsionsgröße und astrozytäre Aktivierung. Ein weiterer Punkt in dieser Studie stellte die Charakterisierung und der Vergleich von spontan-auftretenden Ca2+ Signalen in anästhesierten und wachen P2Y1R Kontroll- und cKO Mäusen dar. Die Applikation von ATP zeigte eine deutliche Veränderung der Ca2+ Signale von Kontroll-Astrozyten mit verstärkten aber kürzeren Signalen von Gliapil und Soma. Im Gegensatz dazu, waren die Ca2+ Signale des P2Y1R cKOs schwächer aber ebenfalls kürzer als die Signale der Kontrollen, was auf einen Verlust des purinergen Signalwegs in Astrozyten hinweist. Veränderungen der Ca2+ Signale im Gliapil des cKOs weisen auf veränderte Ca2+ Signale in den astrozytären Mikrodomänen in den Fortsätzen hin. Die Ca2+ Signale von wachen cKO Mäusen waren noch schwächer und stärker verkürzt, was den starken Einfluss der Anästhesie auf die Ca2+ Signale zeigt. Zusammenfassend konnten wir die Deletion des P2Y1R auf molekularer Ebene nachweisen. Die funktionelle Analyse des cKOs zeigte Veränderungen der Ca2+ Signale, was auf eine wichtige Rolle des Rezeptors für die astrozytäre Funktion hinweist.
Link to this record: urn:nbn:de:bsz:291--ds-299484
hdl:20.500.11880/28343
http://dx.doi.org/10.22028/D291-29948
Advisor: Kirchhoff, Frank
Date of oral examination: 30-Apr-2019
Date of registration: 22-Nov-2019
Faculty: M - Medizinische Fakultät
Department: M - Physiologie
Professorship: 
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