Please use this identifier to cite or link to this item: doi:10.22028/D291-29942
Title: Migration of Primary Human Lymphocytes in 3D matrices
Author(s): Schoppmeyer, Rouven
Language: German
Year of Publication: 2018
Place of publication: Homburg/Saar
SWD key words: Lymphozyt
DDC notations: 610 Medicine and health
Publikation type: Doctoral Thesis
Abstract: Cytotoxic T cells protect us from viruses and tumors and move large distances within the body to find infected or transformed target cells. Their migration is an interplay of their intrinsic ability to migrate and to sense their environment and adapt to it. The composition of extracellular signals and physical contact to connective tissue fibers modulates the migration of T cells. To be able to analyze lymphocyte behavior in 3D I first developed new imaging methods in 3D environments for epifluorescence and Single Plane Illumination Microscopy (SPIM) using collagen as matrix. As a natural non-toxic substrate that is biologically active and can form sponge-like porous matrices that are homogenous and stable under physiological conditions collagen is a perfect starting point to remodel basic tissue architecture and determine basic migration parameters of lymphocytes. Using this collagen based system with a flattened matrix to avoid out of focus migration of cells (2D matrix) I could determine the basic migration parameters of primary human cytotoxic T lymphocytes (CTL) and natural killer cells (NK) in a 3D environment using epifluorescence microscopy. In 0.25 % collagen, representing normal tissue interstitial matrix, lymphocytes migrate in a random walk at average speeds ~ 5 μm min-1 (range ~ 0.6 - 18 μm min-1) and low average persistence. Bead stimulation of CTL that enriches effector and effector memory subtypes, increases average persistence while average velocity is nearly unchanged. By adding extracellular matrix (ECM) compounds the matrix can easily be modified and cell behavior can be modulated. E.g. fibronectin can modulate cell velocity and persistence while fragmented hyaluronic acid, mimicking inflammation or injury, can modulate persistence of CTL. Transferring the collagen system to selected plane illumination microscopy (SPIM) for long term imaging of large 3D volumes SPIM is highly advantageous as it reduces potential toxicity from illumination of the sample and is unraveled in acquisition speed. Additionally the high resolution and frame rate of SPIM systems allows imaging large volumes of containing hundreds of cells or large organoids / spheroids while at the same time catching subcellular dynamic structures like filopodia or actin waves. A system to analyze CTL biology in SPIM experiments was developed and established successfully. Having set up 3D imaging methods we aimed to elucidate the function of a protein central to CTL dynamics governed by actin polymerization: profilin. Many cytosolic proteins are involved in cytoskeletal remodeling yet not much is known about the dynamic control in human CTL. Profilin1 (PFN1) an actin binding protein that lies at the border of cytoskeletal dynamics and signaling pathways, was found, by our Chinese collaborators in Shanghai, to be downregulated in CTL from pancreatic cancer patients. Using overexpression systems of PFN1 (and mutations) with fluorescent fusion proteins and siRNA downregulation we could show that PFN1 is a negative regulator of CTL cytotoxicity and that interactions with phospholipids and regulatory proteins are important for proper regulation of migration. Interestingly actin polymerization rates appear almost unaffected by changes of the relative PFN1:G-actin concentration as is the case for overexpression of PFN1, the Y59A (abolished actin binding) mutant and CTL with siRNA downregulation of PFN1. Apart from this we could show that PFN1 in primary human CTL modulates the protrusion pattern during migration and the release of LGs at the IS via actin structure modulation at the IS. This shows that especially the interplay with phospholipid pathways is an important function for PFN1 apart from supplying actin monomers to polymerizing actin filaments. The results of the profilin study were published in 2017 (Schoppmeyer et al. 2017).
Zytotoxische T Zellen beschützen uns vor Viren und Tumorzellen und müssen dafür große Distanzen im Körper und Gewebe zurücklegen um infizierte oder transformierte Zellen zu finden und eliminieren. T-Zell Migration ist ein Zusammenspiel von extrazellulären Signalen, physischem Kontakt zu Fasern der extrazellulären Matrix, zytoskeletaler Dynamik und dem intrazellulärer Signalwege. Um das Migrationsverhalten von Lymphozyten zu analysieren habe ich zuerst neue Imaging-Methoden entwickelt in 3D Umgebungen für die Epifluoreszenz- und Lichtblattmikroskopie (Selected Plane Illumination Mikroskopie oder SPIM) mit Kollagen als grundlegender Matrix. Diese Methoden werden in dieser Arbeit als 2D Matrix (Epifluoreszenz) und 3D SPIM (Lichtblattmikroskopie) benannt. Die natürliche und nicht toxische Kollagenmatrix ist biologisch aktiv und polymerisiert unter physiologischen Bedingungen zu schwamm-artigen, porösen, homogene und stabilen Matrizen. Dies macht Kollagen zu dem perfekten Startpunkt zur Remodellierung einer grundlegenden Gewebearchitektur und Bestimmung der Grundlegenden Migrationsparameter von Lymphozyten. Mit Hilfe des Kollagen basierten Systems und einer verflachten Matrix (10 - 15 μm) um eine „out of focus“ Migration der Zellen zu verhindern konnte ich Grundlegende Parameter von primären humanen Lymphozyten von gesunden Spendern mit Hilfe des 2D Matrixsystems bestimmen. Lymphozyten migrieren mit einer Zufallsbewegung mit einer Durchschnittsgeschwindigkeit von etwa 5 μm min-1 und niedriger Persistenz in 0.25 % Kollagen. Bead Stimulation von CTL, welche Effektor und Effektor-Gedächtniszellen in der Population anreichert, erhöht die durchschnittliche Persistenz der Population während die Durchschnittsgeschwindigkeit sich kaum verändert. Durch das Hinzufügen von Komponenten der Extrazellulären Matrix (Fibronektin und Hyaluronsäure) ist es relativ einfach möglich die Matrix und damit das Verhalten der darin migrierenden Zellen zu modulieren. Fibronektin z.B. beeinflusst sowohl die Durchschnittsgeschwindigkeit als auch die Persistenz während Hyaluronsäure nur die Persistenz beeinflusst. Zur Langzeitbeobachtung von Zellen unter physiologischen Bedingungen reicht das 2D Matrix System nicht aus auf Grund seiner Limitationen. Der Transfer des kollagen-basierten Systems zu SPIM erlaubt Langzeitaufnahmen von Zellpopulationen in 3D Volumen unter probenschonenden Bedingungen bei gleichzeitiger subzellulärer Auflösung. Das Aktin-Zytoskelett steht zentral zu dynamischen Prozessen in T Zellen und die Polymerisation von Aktinfilamenten ist die treibende Kraft für die Zellbewegung. Eine Vielzahl an Proteinen sind in der Remodellierung
Link to this record: urn:nbn:de:bsz:291--ds-299422
hdl:20.500.11880/28330
http://dx.doi.org/10.22028/D291-29942
Advisor: Hoth, Markus
Date of oral examination: 25-Sep-2018
Date of registration: 21-Nov-2019
Faculty: M - Medizinische Fakultät
Department: M - Biophysik
Professorship: 
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