Please use this identifier to cite or link to this item: doi:10.22028/D291-29681
Title: Complexity of Ca2+ signals in astrocytes : Contribution of astroglial GABAB receptors
Author(s): Stopper, Laura
Language: English
Year of Publication: 2018
Place of publication: Homburg/Saar
SWD key words: GABAB-Rezeptor
DDC notations: 610 Medicine and health
Publikation type: Doctoral Thesis
Abstract: ZUSAMMENFASSUNG Neben Neuronen sind Astrozyten an der Signalübertragung der Synapse beteiligt. Dafür sind sie mit einer Vielzahl von Rezeptoren ausgestattet. Einer dieser Rezeptoren ist der metabotrope GABAB-Rezeptor, der durch den Transmitter GABA (Ɣ-Aminobuttersäure) aktiviert wird. In Neuronen führt die Aktivierung des GABAB-Rezeptors, bestehend aus GABAB1- und GABAB2-Untereinheit, zu einer Aktivierung des inhibitorischen G-Proteins. Abhängig von der Position des Rezeptors kommt es dadurch zu einer Inhibition von Kaliumkanälen oder zu einer Verlängerung der Öffnungswahrscheinlichkeit von Kalziumkanälen. Die Expression und auch die Funktionalität von GABAB-Rezeptoren auf Astrozyten wurde bereits beschrieben, aber die nachgeschaltete Signalkaskade und die Funktion in der Interaktion mit Neuronen ist bisher noch nicht geklärt. Eine Veränderung des intrazellulären Kalziums wird vermutet. Daher haben wir eine Mauslinie generiert, in der die essentielle GABAB1-Untereinheit spezifisch in Astrozyten deletiert wird. Hierfür wurde die Tamoxifen induzierbare GLAST-CreERT2-Mauslinie mit der gefloxten GABAB1-Linie verpaart (GLAST-CreERT2xGABAB1fl/fl). Durch den Verlust der GABAB1-Untereinheit kann kein GABAB-Rezeptor mehr gebildet werden. Ein Teil der GLAST-CreERT2xGABAB1fl/fl-Linie exprimiert außerdem den genetisch codierten Kalziumindikator GCaMP3, um in vivo Kalziumsignale von Kontroll- und Knockout-Tieren zu analysieren. In einen ersten Schritt wurde die genomische DNA Rekombinationseffizienz des gefloxten gabbr1 Alleles mittels quantitativer real-time PCR in verschiedenen Gehirnarealen drei Wochen nach Tamoxifen-Administration untersucht. Die Analyse der genomischen DNA in den verschiedenen Gehirnarealen; Hirnstamm, Zerebellum, Kortex, Hippocampus und optischer Nerv, zeigte eine Reduktion der gefloxten gabbr1 Allele (30%, 25%, 25%, 29%, 38%). Diese Reduktion spiegelt auch das relative Verhältnis der Astrozyten in den verschiedenen Regionen wieder. Außerdem konnte eine Reduktion um 50% an gefloxten gabbr1 Allelen in MACS-isolierten kortikalen Astrozyten beobachtet werden. Auf Grund der hohen Expression der GABAB-Rezeptoren in Neuronen und anderen Zellentypen konnten keine GABAB1 mRNA Reduktion in totalen Zellhomogenaten mittels RT-PCR identifiziert werden. In einer NGS-Analyse der GABAB1 mRNA in MACS-isolierten Astrozyten aus Zerebellum und Kortex konnte eine Reduktion von 50-70% gezeigt werden. Mittels Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) konnte der Verlust der mRNA spezifisch in Astrozyten in Zerebellum, Hippocampus und Kortex nachgewiesen werden. Eine genaue Analyse der Expression des GABAB1 Protein auf der Membran von Astrozyten mittels Immunhistochemie zeigte den Verlust des Proteins in Kortex, Hippocampus und Zerebellum. Die Sprache der Astrozyten sind die Kalziumsignale. Um die Auswirkung des Verlustes der astrozytären GABAB-Rezeptoren auf die Kalziumsignale zu evaluieren, wurden anästhesierten und wachen Mäusen mittels 2-Photonen-Mikroskopie untersucht. In vivo führt die Deletion von astrozytären GABAB-Rezeptoren zu kleineren und kürzeren Kalziumsignalen im Gliapil von anästhesierten Mäusen. In wachen Tieren sind neben den Signalen im Gliapil, auch somatische Kalziumsignale kleiner und kürzer in der Abwesenheit von GABAB-Rezeptoren in Astrozyten. Zusammenfassend konnte die Deletion der essentiellen GABAB1-Untereinheit gezeigt werden. Außerdem konnte gezeigt werden, dass GABAB-Rezeptoren einen Beitrag zu der Komplexität der Kalziumsignale beitragen.
ABSTRACT Astrocytes are decisively involved in synaptic transmission and for this purpose equipped with transmitter receptors capable of sensing neuronal activity. One of these receptors is the metabotropic GABAB receptor, a target of the main inhibitory neurotransmitter γ-aminobutyric acid (GABA). In neurons, activation of GABAB receptors (formed by dimerization of GABAB1 and GABAB2 subunits) leads to an activation of inhibitory G proteins, resulting in prolonged of opening time of Ca2+ channels or inhibition of potassium channels, depending on the localization of the receptors. The presence and the functionality of astrocytic GABAB receptors are already described but the downstream signaling and the influence in communication of the astrocytes remains unclear. Recent publication suggest a link to intracellular Ca2+ signals. Therefore, we generated a genetically modified mouse model where an astroglia-specific deletion of the essential GABAB receptor subunit GABAB1 could be induced by crossbreeding GLAST-CreERT2 with floxed GABAB1 mice (GLAST-CreERT2 x GABAB1 fl/fl). After deleting the GABAB1 subunit no functional receptor can be formed. A subset of GLAST-CreERT2 x GABAB1 fl/fl also expressed the genetically encoded Ca2+ indicator GCaMP3 allowing in vivo Ca2+ imaging in cKO and control. First, we quantified the genomic DNA recombination efficiency of the floxed gabbr1 alleles in different brain region by real-time PCR three weeks after the tamoxifen injection. Analysis of genomic DNA purified from brainstem, cerebellum, cortex, hippocampus and optic nerve revealed a significant reduction of floxed gabbr1 alleles (30%, 25%, 25%, 29%, and 38%, respectively). This reflects the relative proportion of astroglia in the respective regions. Furthermore, we could detect loss of 50% of floxed gabbr1 alleles in MACS isolated cortical astrocytes. Due to the high expression of neuronal GABAB receptors and the expression of GABAB receptors on other cell types a reduction of GABAB1 mRNA could not be detected in brain homogenates by real-time PCR. However, using NGS we could detect a significant loss of the GABAB1 mRNA on MACS isolated cerebellar and cortical astrocytes (50% and 70%, respectively). Futhermore by using fluorescence in situ hybridization (FISH) we could visualize the loss of mRNA specifically in astrocytes in the cerebellum, hippocampus and cortex. A detailed analysis of GABAB1 protein expression in the astrocyte membrane revealed a loss of the protein on the membrane in cortex, hippocampus and cerebellum with immunohistochemistry. Astrocytes communicate through Ca2+ signals. To reveal the impact of GABAB receptors on Ca2+ signals, signals in anesthetized and awake animals were analyzed with the two-photon laser scanning microscopy. In vivo the deletion of astrocytic GABAB receptors resulted in only smaller and shorter Ca2+ signals in the gliapil of awake and anesthetized animals. In awake animals next to the signals in the gliapil, also somatic Ca2+ signals were smaller and shorter in the absence of astrocytic GABAB receptors. In summary, the deletion of the essential GABAB1 subunit could be proven and furthermore GABAB receptors play an important in the complexity of Ca2+ signals.
Link to this record: urn:nbn:de:bsz:291--ds-296814
hdl:20.500.11880/28093
http://dx.doi.org/10.22028/D291-29681
Advisor: Kirchhoff, Frank
Date of oral examination: 30-Apr-2019
Date of registration: 15-Oct-2019
Faculty: M - Medizinische Fakultät
Department: M - Physiologie
Professorship: 
Collections:SciDok - Der Wissenschaftsserver der Universität des Saarlandes

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