Isolierte mikrovaskuläre Fragmente aus Fettgewebe zur Vaskularisierung von Scaffolds für das Tissue Engineering

Abstract

Das Ziel des Tissue Engineerings ist es, ein funktionsfähiges Ersatzgewebe zu generieren. Hierzu werden Zellen auf eine Trägermatrix (Scaffold) übertragen und anschließend in einen Gewebedefekt implantiert. Wesentlich für das Überleben eines solchen Gewebekonstrukts ist eine effiziente Blutversorgung, um eine ausreichende Versorgung mit Sauerstoff und Nährstoffen zu gewährleisten. Das Einwachsen von Blutgefäßen aus dem umliegenden Gewebe in das Implantat ist jedoch oftmals nicht ausreichend, um eine frühzeitige Durchblutung sicherzustellen. Aus diesem Grund wurde kürzlich eine neue Methode etabliert, bei der die Vaskularisierung von Scaffolds durch die Besiedlung mit Gefäßfragmenten aus Spenderfettgewebe deutlich verbessert werden kann. So verbinden sich die Gefäßfragmente schnell zu einem neuen Gefäßnetzwerk, welches mittels Inoskulation Anschluss an das Gefäß-system des umliegenden Gewebes herstellt. Aufgrund des demographischen Wandels werden in Zukunft besonders ältere Menschen auf das Tissue Engineering angewiesen sein. Vor diesem Hintergrund wurde in der vorliegenden Arbeit erstmals untersucht, inwiefern die Fähigkeit isolierter Gefäßfragmente, neue Gefäßnetzwerke auszubilden, vom Alter des Fett-gewebsspenders abhängig ist. Hierzu wurden aus dem Nebenhodenfettgewebe von 8- bzw. 16- Monate alten C57BL/6-Spendermäusen Gefäßfragmente isoliert, auf Scaffolds übertragen und dann in die Rückenhautkammern von 3 - 4 Monate alten C57BL/6-Empfängermäusen implantiert. Die Vaskularisierung der Scaffolds wurde über einen Zeitraum von 14 Tagen mithilfe der intravitalen Fluoreszenzmikroskopie, histologischen und immunhistochemischen Verfahren analysiert. Die vorliegende Untersuchung zeigt, dass Scaffolds mit Gefäßfragmenten aus alten Spendermäusen eine signifikant niedrigere funktionelle Kapillardichte aufwiesen und schlechter perfundiert wurden als Scaffolds mit Gefäßfragmenten aus adulten Spendermäusen. Die neu gebildeten Gefäßnetzwerke innerhalb der Scaffolds mit Gefäßfragmenten aus alten Spendermäusen waren zudem schlechter ausgereift. Weiterhin zeigte sich bei immunhistochemischer Detektion von CD31/α-smooth muscle actin (SMA)-positiven Blutgefäßen eine deutlich geringere Gefäßdichte in diesen Scaffolds. Hieraus lässt sich schließen, dass Gefäßfragmente alter Spendermäuse über ein reduziertes Vaskularisierungspotential im Vergleich zu Gefäßfragmenten adulter Spendermäuse verfügen. Das Alter der Fettgewebsspender hat dabei einen entscheidenden Einfluss auf die Ausreifung der Gefäßnetzwerke. Durch die Besiedlung von Scaffolds mit isolierten Gefäßfragmenten kann eine adäquate Blutperfusion im Inneren der Scaffolds erst nach 6 bis 10 Tagen erreicht werden. In einem zweiten Studienabschnitt wurde daher untersucht, ob die lokale Applikation des pro-angiogenen Faktors macrophage-activating lipopetide-2 (MALP-2) das Einwachsen von Blutgefäßen in die Scaffolds beschleunigt und somit die frühzeitige Vaskularisierung der Scaffolds verbessert. Hierzu wurde das Deckglas der Rückenhautkammer 30 Minuten vor Implantation der Scaffolds entfernt und Vehikel oder MALP-2 lokal auf das Gewebe appliziert. Anschließend wurde die Vaskularisierung der Scaffolds und die leukozytäre Entzündungsreaktion über einen Zeitraum von 14 Tagen mithilfe der repetitiven intravitalen Fluoreszenzmikroskopie, histologischen und immunhistochemischen Verfahren analysiert. Die Anzahl adhärenter Leukozyten in Venolen der Rückenhautkammer war in der MALP-2-Gruppe in den ersten 3 Tagen nach Applikation signifikant erhöht. Zudem zeigte sich bei immunhistochemischer Detektion von CD31/SMA-positiven Blut-gefäßen eine erhöhte Gefäßdichte im Gewebe um die Implantate. Im Gegensatz dazu war das Zentrum der Scaffolds in der MALP-2-Gruppe weniger stark vaskularisiert und wies eine geringere funktionelle Kapillardichte als in der Kontroll-Gruppe auf. Dies war dadurch bedingt, dass MALP-2 in den perivaskulären Zellen und Endothelzellen der isolierten Gefäßfragmente Apoptose induzierte. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass MALP-2 die angiogene Reaktion des Kammergewebes auf implantierte Scaffolds verbessert, aber die Ausreifung eines adäquaten Gefäßnetzwerkes in Gefäßfragment-besiedelten Implantaten verhindert. Die lokale Applikation von MALP-2 in Verbindung mit isolierten Gefäß-fragmenten ist somit nicht für zukünftige klinische Anwendungen zu empfehlen.

The aim of tissue engineering is the generation of functional tissue substitutes. For this purpose cells are seeded on a matrix (scaffold), which is subsequently implanted into a tissue defect. A major prerequisite for the survival of such a tissue construct is an efficient vascularization, which guarantees an adequate supply with oxygen and nutrients. However, the ingrowth of newly formed blood vessels from the surrounding tissue into the implant is often not sufficient enough to induce a rapid vascularization. Therefore, a new prevascularization approach has recently been introduced, seeding scaffolds with adipose tissue-derived microvascular fragments. These microvascular fragments rapidly reassemble into functional microvascular networks within the implants and develop interconnections to the host microvasculature. Elderly patients are the major future target population for tissue engineering applications due to an increasing human life expectancy. Therefore, the first aim of this thesis was to investigate whether aging of the donor influences the fragments’ vascularization capacity. To study this, microvascular fragments were isolated from the epididymal fat pads of adult (8 months) and aged (16 months) C57BL/6 donor mice. These fragments were seeded onto scaffolds, which were implanted into dorsal skinfold chambers of 3 - 4 month old C57BL/6 recipient mice. The vascularization of the scaffolds was analyzed by means of intravital fluorescence microscopy, histology and immunohistochemistry over an observation period of 14 days. Scaffolds seeded with the fragments from the aged donors exhibited a significantly lower functional microvessel density and an impaired blood perfusion when compared to scaffolds seeded with fragments from adult donors. This was associated with an impaired vessel maturation. The immunohistochemical detection of CD31/ α-smooth muscle actin (SMA)-positive microvessels revealed a markedly decreased microvessel density in the tissue surrounding the implants. These findings indicate that microvascular fragments from aged donors exhibit a reduced vascularization capacity when compared to microvascular fragments from adult donors. Thereby, the age of the fat donors crucially determines the maturation of the newly developing microvasculature. By seeding of scaffolds with microvascular fragments an adequate blood perfusion can only be observed after 6-10 days in the center of the implants. Therefore, the second aim of this thesis was to analyze whether a single application of the pro-angiogenic factor macrophage-activating lipopetide-2 (MALP-2) at the implantation site may further accelerate the vascularization of the constructs. For this purpose, MALP-2 or vehicle (control) where locally applied on the exposed tissue 30 minutes before the implantation of the Scaffolds. The vascularization of the scaffolds and the inflammatory host tissue response were analyzed by means of intravital fluorescence microscopy, histology, and immunohistochemistry. MALP-2 chambers showed a significantly increased number of adherent leukocytes in venules during the first 3 days after application. Furthermore, the immunohisto-chemical detection of CD31/SMA-positive microvessels revealed an increased micro-vessel density in the tissue surrounding the implants. In contrast, the vascularization of the scaffolds` center was reduced, as indicated by a decreased microvessel density when compared to the control group. This was caused by the fact that MALP-2 induced apoptotic cell death of the endothelial and perivascular cells in isolated microvascular fragments. In summary, these results show that the angiogenic host tissue response is improved by MALP-2 application. However, the vascularization capacity of microvascular fragments is impaired. Accordingly, the simultaneous use of MALP-2 and isolated microvascular fragments can not be recommended for future clinical applications.