Please use this identifier to cite or link to this item: doi:10.22028/D291-27984
Title: Expression der LRRC52 γ-Untereinheit (γ2) und die Ca2+-unabhängige Aktivierung von BK-Kanälen in Inneren Haarsinneszellen der Maus
Author(s): Lang, Isabelle
Language: German
Year of Publication: 2019
DDC notations: 570 Life sciences, biology
Publikation type: Doctoral Thesis
Abstract: Die calcium- und spannungsabhängigen big conductance (BK) Kaliumkanäle sind an einer Vielzahl physiologischer, aber auch pathophysiologischer Prozesse beteiligt. Sie werden in vielen unterschiedlichen Gewebstypen, einschließlich der Cochlea, exprimiert. In dieser finden die Schalltransduktion und die Weiterleitung der Signale über den Hörnerven ins Gehirn statt. Die BK-Kanäle sind in den reifen sensorischen inneren Haarsinneszellen (IHZ) für die schnelle Repolarisation des Rezeptorpotentials und die kleinen Membranzeitkonstanten verantwortlich, womit eine schnelle Reaktion auf Änderungen des Membranpotentials möglich ist. Obwohl die BK-Kanäle in IHZ bereits bei einer Membranspannung von -75 mV mit einer halbmaximalen Aktivierungsspannung von -50 mV öffnen, ist der schnell aktivierende BK-Strom (IK,f) unabhängig vom Ca2+-Einstrom über spannungsgesteuerte Calciumkanäle (Cav1.3-Kanäle) am synaptischen Pol der IHZ. Dieses Paradoxon konnte bislang noch nicht aufgelöst werden. Ziel der Arbeit war es, einen alternativen Aktivierungsmechanismus für BK-Kanäle in Säugern nachzuweisen, der sich von der bekannten BK-Aktivierung mittels Ca2+-Einstrom durch benachbarte Cav1.3-Kanäle in Haarzellen von Vögeln, Reptilien und Amphibien unterscheidet. Mit konfokaler Immunhistochemie wurde in dieser Arbeit die subzelluläre Lokalisation der porenbildenden BKα-Untereinheit im Vergleich zu den Tight Junctions, den Cav1.3-Kanälen und dem Endoplasmatischen Retikulum (ER) in den IHZ von Mäusen untersucht. IHZ weisen zwei räumlich getrennte BKα-Subpopulationen auf, wobei die Hauptpopulation, die als Cluster am Hals der IHZ lokalisiert ist, die größte physiologisch noch sinnvolle Entfernung unterhalb der Tight Junctions zu den präsynaptischen Cav1.3-Kanälen aufweist. In der Nähe präsynaptischer Cav1.3-Kanäle konnte nur eine kleine BKα-Subpopulation identifiziert werden. BKα-Kanal-Cluster waren zudem nicht in der Nähe des ERs lokalisiert, welches als mögliche Ca2+-Quelle hätte dienen können. Die Ca2+-unabhängige Aktivierung von BK-Kanälen bei negativen Potentialen kann durch die neu entdeckten γ-Untereinheiten, die Leucin-rich repeat-containing Proteine, LRRC26 (γ1) und LRRC52 (γ2), die in heterologen Expressionssystemen die halbmaximale Aktivierungsspannung der BK-Ströme um -140 mV bzw. -100 mV verschieben, ausgelöst werden. Mit nested PCR, Immunfluoreszenzanalysen und dem in situ Proximity Ligation Assay (is-PLA) wurden unreife und reife Corti-Organe bzw. IHZ von Mäusen auf das Vorliegen von LRRC26 und LRRC52 analysiert. In reifen IHZ konnten mit nested PCR Transkripte für LRRC52, nicht jedoch für LRRC26 nachgewiesen werden. Konsistent dazu wurden keine LRRC26-Proteine, aber eine synchrone Hochregulation von LRRC52 und BKα mit Hörbeginn in den IHZ von Wildtyp-Mäusen identifiziert. Darüber hinaus kolokalisierten beide Proteine in Clustern am Hals der IHZ. Mithilfe des is-PLA wurde eine räumliche Nähe von ≤ 40 nm von LRRC52 und BKα nachgewiesen. Zusätzlich wurde in zwei Knockout-Mausmodellen, BKα-/- - und Cav1.3-/- -Mäusen, denen die BKα-Untereinheit fehlt, die Abwesenheit von LRRC52 in reifen IHZ festgestellt. Die synchrone entwicklungsabhängige Hochregulation von LRRC52 mit BKα zu Hörbeginn, ihre Kolokalisation in einem Abstand von ≤ 40 nm am Hals der IHZ und die Abhängigkeit der LRRC52-Expression von der Anwesenheit von BKα weisen LRRC52 als γ2-Untereinheit der BK-Kanäle in IHZ aus. Ein funktioneller Nachweis bleibt zukünftigen Experimenten, z.B. der Analyse einer LRRC52-knockout-Maus, vorbehalten.
The big conductance, voltage and calcium-activated K+ (BK) channels participate in a large variety of physiological but also pathophysiological processes. They are expressed in various tissues including the cochlea in both excitable and non-excitable cells. The cochlea transduces sound into transmitter release and converts the information to the auditory brainstem by the acoustic nerve. BK channels are responsible for fast repolarization of the receptor potential and small time constants of the mature inner hair cell (IHC), enabling it to respond very quickly to changes in membrane potential. Although they activate at around -75 mV with a voltage of half-maximum activation of -50 mV the fast activating BK current (IK,f) is largely insensitive to Ca2+ influx through presynaptic voltage-gated calcium (Cav1.3) channels, a paradox that has not been resolved so far. The aim of this thesis was to identify an alternative activation mechanism for BK channels in mammalian IHCs distinct to the known BK channel activation by Ca2+ influx through adjacent Cav1.3 channels common to hair cells of birds, reptiles and amphibians. Using confocal immunohistochemistry, the subcellular localization of the pore-forming BKα subunit with respect to tight junctions, Cav1.3 channels and the endoplasmic reticulum (ER) was analyzed in mature IHCs. IHCs show a subcellular spatial segregation of two BKα populations with the large population localized at the IHC neck directly underneath the tight junction ring at the largest possible distance from presynaptic Cav1.3 channels. A much smaller population of BKα channels was however identified in proximity to presynaptic Cav1.3 channels. BK channel clusters at the IHC neck were not localized close to the ER, which could have served as an internal store for Ca2+. Ca2+-independent activation of BK channels at negative potentials can be caused by newly detected γ subunits, the Leucin-rich repeat-containing proteins, LRRC26 (γ1) and LRRC52 (γ2), which upon heterologous expression can shift the voltage of half-maximum activation of the BK current by -140 mV and -100 mV, respectively. Immature and mature mouse organs of Corti and IHCs were analyzed for LRRC26 and LRRC52 with nested PCR, immunofluorescence analysis and in situ Proximity Ligation Assay (is-PLA). In mature IHCs, transcripts for LRRC52 but not for LRRC26 could be detected using a nested PCR approach. Consistently, no LRRC26 protein expression was found in IHC of wildtype mice. However, a synchronous developmental up-regulation of LRRC52 with the pore-forming BKα subunit was identified at the onset of hearing resulting in the co-localization of both proteins in clusters at the IHC neck. Furthermore, a close proximity of LRRC52 and BKα within ≤ 40 nm was specified using is-PLA. Additionally, LRRC52 was absent from mature IHCs of BKα- and Cav1.3-deficient mice, which both lack BKα protein. Taken together, the synchronous developmental up-regulation of LRRC52 with BKα at the onset of hearing, their co-localization within a distance of ≤ 40 nm at the IHC neck and the BKα-dependent expression of LRRC52 identify LRRC52 as γ2 subunit of BK channels in IHC. Future experiments are needed to functionally proof the role of LRRC52 for the activation of BK channels, e.g. using a LRRC52-knockout mouse model.
Link to this record: urn:nbn:de:bsz:291--ds-279849
hdl:20.500.11880/28011
http://dx.doi.org/10.22028/D291-27984
Advisor: Engel, Jutta
Date of oral examination: 10-Sep-2019
Date of registration: 7-Oct-2019
Description of the related object: Veröffentlichung in wissenschaftlichem Journal
Related object: https://www.fasebj.org/doi/10.1096/fj.201900701RR
Faculty: M - Medizinische Fakultät
Department: M - Biophysik
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