Etablierung der Elektron-Spin-Resonanz Spektroskopie als Nachweismethode für die Superoxidproduktion in lebenden Zellen: Optimierung eines Messprotokolls und Untersuchungen zur Kinetik und der Rolle von Kalzium bei der Aktivierung der NADPH-Oxidase

Abstract

Hintergrund: Atome und Moleküle, die ein ungepaartes Elektron besitzen, werden in der Chemie als Radikale bezeichnet. Im Organismus entstehen sie sowohl als Endprodukt einer gezielten Reaktion, als auch als Nebenprodukt einzelner Stoffwechselvorgänge. Alle Radikale haben eine hohe Reaktionsfreudigkeit und die damit verbundene meist sehr kurze Lebensdauer gemeinsam. Radikale und Moleküle, die sich durch schrittweise Reduktion von Sauerstoff ableiten und stark oxidierend wirken beziehungsweise leicht weitere Radikale bilden, werden als reaktive Sauerstoffspezies oder „Reactive Oxygen Species“ bezeichnet. Diese können im menschlichen Organismus aus einer Vielzahl von Reaktionen und Quellen entstehen. Eine der wichtigsten Quellen ist das Enzym NADPH-Oxidase. Je nach Lokalisation, Konzentration und Art der reaktiven Sauerstoffspezies, können diese als Botenstoff in Signalwegen des Organismus oder „Abwehrtoxin“ in der angeborenen Immunantwort dienen. Treten sie allerdings gehäuft und ungezielt zum Beispiel in der Pathogenese der Atherosklerose auf, sind sie als körperschädliches Toxin anzusehen. Vor diesem Hintergrund sind das genaue Messen zum einen, und das Verständnis der physiologischen Vorgänge in der Entstehung der reaktiven Sauerstoffspezies zum anderen bedeutend. Monozyten besitzen große Mengen des Enzyms NADPH-Oxidase und produzieren signifikante Mengen an Sauerstoffradikalen während der Immunantwort. Bislang stellen die genaue Quantifizierung und die Reaktionskinetik der Radikalentstehung eine große Herausforderung dar. Methode: Die Elektron-Spin-Resonanz Spektroskopie kann Radikale, aufgrund des Spins ihres ungepaarten Elektrons, selektiv messen. In dieser Arbeit wurden die Reaktionskinetik und Produktion von Sauerstoffradikalen durch Monozyten mit Hilfe zyklischer Hydroxylamine und der Elektron Spin Resonanz Spektroskopie untersucht. Es wurden THP-1 Monozyten und CD14+ Monozyten gesunder menschlicher Spender verwendet. Diese wurden mit dem Phorbolester Phorbol-12-myristat-13-acetat und Thapsigargin stimuliert. So konnte die Superoxidradikalproduktion nach Aktivierung der NADPH-Oxidase über verschiedene Signalwege untersucht werden. Das Identifizieren des Radikals als Superoxid ließ sich über ein Unterdrücken des Messsignals mit Superoxid-Dismutase erreichen. Ergebnis: Ringerpuffer scheint der beste Messpuffer für die Messungen von Zellen mit Elektron-Spin-Resonanz Spektroskopie zu sein. Hier konnte bei möglichst physiologischer Zusammensetzung das geringste störende Hintergrundsignal detektiert werden. THP-1 Monozyten produzieren unter gleichen Bedingungen deutlich weniger Superoxidradikale als die CD14+ Monozyten gesunder menschlicher Spender. Außerdem konnte gezeigt werden, dass Phorbol-12-myristat-13-acetat bei Monozyten eine sechsmal höhere Produktionsrate an Superoxidradikalen induziert als Thapsigargin. Ferner ist diese höhere Produktionsrate komplett unabhängig von der extrazellulären Kalziumkonzentration. Thapsigargin hingegen stimuliert die Radikalbildung in Monozyten absolut kalziumabhängig. Auch die Kinetik ist eine völlig andere. Anders als die Stimulation mit Phorbol-12-myristat-13-acetat, welche zunächst eine lineare Reaktionskinetik und nach Verbrauch des Substrates Sauerstoff eine Sättigung zeigt, weist die Stimulation mit Thapsigargin eine sigmoidale Kinetik auf. Schlussfolgerung: Es ist gelungen, ein Messprotokoll zu erstellen, das es unserer Arbeitsgruppe erlaubt, Sauerstoffradikale zu quantifizieren und ihre Reaktionskinetik zu beschreiben. Thapsigargin induziert alleine durch Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration die Bildung von Superoxidradikalen. Diese kann durch Hemmung der NADPH-Oxidase ebenso wie durch das Hemmen der Proteinkinase C unterdrückt werden. Auch das Entfernen des extrazellulären Kalziums verhindert die Superoxidproduktion durch Thapsigargin. Allein durch die Methode der Elektron-Spin-Resonanz Spektroskopie konnte somit gezeigt werden, dass der kalziuminduzierte Kalziumeinstrom auch in Monozyten eine Hauptrolle in der Regulation und Aktivierung der NADPH-Oxidase einnimmt.

Background: Atoms and molecules that carry an unpaired electron are called radicals in chemistry. In the organism, they are formed as the end product of a targeted reaction and as a by-product of individual metabolic processes. All radicals have a high reactivity and a very short lifetime in common. Radicals and molecules, which are derived from sequential reduction of oxygen and show a strong oxidizing effect or easily are forming further radicals, are called "Reactive Oxygen Species". These can arise in the human organism from a multitude of reactions and sources. One of the most important sources is the enzyme NADPH oxidase. Depending on localization, concentration and type of reactive oxygen species, they serve as messenger substances in signaling pathways of the organism or as "defence toxins" in the innate immune response. However, if they occur frequently and uncontrolled, for example in the pathogenesis of atherosclerosis, they are regarded as body-damaging toxins. Against this background, the exact measurement on the one hand and the understanding of the physiological processes in the development of the reactive oxygen species on the other hand are important. Monocytes possess large amounts of the enzyme NADPH oxidase and produce significant amounts of oxygen radicals during the immune response. Precise quantification and understanding the reaction kinetics of radical formation still pose a major challenge. Methods: Electron spin resonance spectroscopy can selectively measure radicals due to the spin of their unpaired electron. In this thesis, the reaction kinetics and the production of oxygen radicals by monocytes, using cyclic hydroxylamines and electron spin resonance spectroscopy, were investigated. THP-1 monocytes and CD14+ monocytes from healthy human donors were used. These were stimulated with the phorbol ester phorbol-12-myristate- 13-acetate and thapsigargin. Thus, superoxide radical production after activation of NADPH oxidase via various signaling pathways could be investigated. The identification of the radical as superoxide could be achieved by suppressing the measured signal with superoxide dismutase. Result: Ringer's buffer seems to be the best measuring buffer for cell measurements with electron spin resonance spectroscopy. This buffer caused the smallest disturbing background signal and had a composition that was as physiological as possible. THP-1 monocytes produce significantly less superoxide radicals under the same conditions as the CD14+ monocytes of healthy human donors. In addition, our results indicate that the production rate of superoxide after PMA stimulation is six-fold higher than that after stimulation with thapsigargin. Furthermore, this higher production rate is completely independent of extracellular calcium concentration. Thapsigargin, on the other hand, stimulates the formationof radicals in monocytes absolutely dependent on calcium. The kinetics are also completely different. Unlike stimulation with PMA, which initially has a linear reaction kinetics and shows saturation after consumption of the substrate oxygen, stimulation with Thapsigargin has a sigmoidal kinetics. Conclusion: We have succeeded in establishing a measurement protocol that allows our research group to quantify oxygen radicals and describe their reaction kinetics. Thapsigargin induces the formation of superoxide radicals by increasing the intracellular calcium concentration alone. This can be suppressed by inhibition of NADPH oxidase as well as by inhibition of protein kinase-C. Removal of extracellular calcium also prevents superoxide production by thapsigargin. Using electron-spin resonance spectroscopy as the main tool, we showed that store-operated calcium entry plays a major role in the regulation and activation of NADPH oxidase in monocytes.