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doi:10.22028/D291-28361
Titel: | Sec61 interactor analysis by chemical crosslinking |
VerfasserIn: | Pereira, Fabio |
Sprache: | Englisch |
Erscheinungsjahr: | 2019 |
DDC-Sachgruppe: | 570 Biowissenschaften, Biologie |
Dokumenttyp: | Dissertation |
Abstract: | The Sec61 complex is a heterotrimeric complex responsible for the translocation of secretory proteins through the endoplasmic reticulum (ER) membrane. Sec61, the pore forming subunit of the channel, is a transmembrane protein with 10 transmembrane domains. Its lumenal loops are mostly short, with the exception of L5, which is the hinge that allows channel opening, and a large luminal loop (L7). Proteins that misfold in the endoplasmic reticulum are transported back to the cytosol for ER-associated degradation (ERAD). The Sec61 channel is also one of the candidates for the retrograde transport conduit. In this work I developed and optimized a chemical crosslinking setup using ER membranes. Upon purification and mass spectrometry analysis of crosslinked samples I was able to identify new Sec61 interactors. In addition to known interactors I detected new interactions with ERAD factors including Cue1, Ubc6, Ubc7, Asi3, and Mpd1. I show that a substrate dependent on Asi3 for degradation (Erg11), is also Sec61 dependent. Moreover, I show that the CPY* ERAD factor Mpd1 binds to the lumenal Sec61 hinge region. Deletion of the Mpd1 binding site reduced the interaction between both proteins and caused an ERAD defect specific for CPY* without affecting protein import into the ER or ERAD of other substrates. My data suggest that Mpd1 binding to Sec61 is a prerequisite for CPY* ERAD and confirm a role of Sec61 in ERAD of misfolded secretory proteins. Der Sec61-Komplex ist ein heterotrimerer Proteinkomplex, der sekretorische Proteine ins Endoplasmatische Retikulum (ER) transloziert. Die porenbildende Untereinheit des Komplexes, Sec61, hat 10 Transmembrandomänen. Die meisten ER-lumenalen Loops von Sec61 sind kurz, bis auf L5, das die Verbindung oder Angel zwischen der N- und der C-terminalen Hälfte des Kanals bildet, um die sich die N-terminale Hälfte bei der Kanalöffnung bewegt, und den langen L7. Proteine, die im ER fehlfalten, werden zum Abbau zurück ins Zytosol transportiert (ER-assoziierte Degradation, ERAD). Der Sec61 Kanal ist einer der Kanal-Kandidaten für den retrograden Proteintransport. In meiner Arbeit habe ich eine chemische Crosslinking-Methode für Sec61-Interaktoren ausgearbeitet und optimiert für Mikrosomen. Ich reinigte die Sec61-Komplexe und analysierte ihre Komponenten durch Massenspektrometrie. Es gelang mir, neue ERlumenale Interaktionspartner von Sec61 zu identifizieren. Zusätzlich zu bekannten Sec61-bindenden Proteinen detektierte ich ERAD-Faktoren in den Sec61-Komplexen wie Cue1, Ubc6, Ubc7, Asi3 und Mpd1. Ich habe gezeigt, dass der Ubiquitinligase Asi3-abhängige Abbau von Erg11 ebenfalls abhängig ist von Sec61. Weiterhin habe ich gezeigt, dass der CPY*-spezifische ERAD-Faktor Mpd1 an den lumenalen L5 von Sec61 bindet. Deletion der Mpd1-Bindestelle in L5 reduzierte die Interaktion zwischen Sec61 und Mpd1 und führte zu einem ERAD-Defekt für CPY* ohne ER-Import oder ERAD anderer Substrate zu beeinträchtigen. Meine Daten zeigen, dass Mpd1- Interaktion mit Sec61 eine Voraussetzung für CPY*-ERAD ist, und bestätigen eine Beteiligung von Sec61 am ERAD fehlgefalteter sekretorischer Proteine. |
Link zu diesem Datensatz: | urn:nbn:de:bsz:291--ds-283618 hdl:20.500.11880/27749 http://dx.doi.org/10.22028/D291-28361 |
Erstgutachter: | Römisch, Karin |
Tag der mündlichen Prüfung: | 22-Jul-2019 |
Datum des Eintrags: | 11-Sep-2019 |
Fakultät: | NT - Naturwissenschaftlich- Technische Fakultät |
Fachrichtung: | NT - Biowissenschaften |
Sammlung: | SciDok - Der Wissenschaftsserver der Universität des Saarlandes |
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