Please use this identifier to cite or link to this item: doi:10.22028/D291-28417
Title: Validierung und Target-Identifizierung der metastasierungsassoziierten microRNAs miR-30e-3p und miR-139-5p zur Prognosebewertung des klarzelligen Nierenzellkarzinoms
Author(s): Pleyers, Anna Ramona
Language: German
Year of Publication: 2018
Place of publication: Homburg/Saar
SWD key words: Hypernephrom
miRNS
Free key words: miR-30e-3p
miR-139-5p
DDC notations: 610 Medicine and health
Publikation type: Doctoral Thesis
Abstract: Das klarzellige Nierenzellkarzinom (kNZK) ist mit ca. 80-90% der häufigste bösartige Tumor der Niere. Die Prognose ist insbesondere vom Metastasierungspotential abhängig. Insge-samt weisen etwa 20% der Patienten bereits bei der Erstdiagnose eine Metastasierung auf, weitere 20% der Patienten entwickeln im Verlauf metachrone Metastasen. Dabei liegt die 5-Jahres-Überlebensrate unter 10%. Nach den aktuellen Leitlinien von 2017 wird keine Empfehlung für eine adjuvante Therapie ausgesprochen. Um eine individuelle Prognosebe-wertung sowie eine Verbesserung der adjuvanten Therapie und Nachsorge bei Patienten mit metastasiertem kNZK zu erreichen, sind zuverlässige molekulare Marker erforderlich. Hier haben sich in den letzten Jahren microRNAs (miRNAs) als vielversprechende Kandidaten erwiesen. Diese kleinen einzelsträngigen RNA-Moleküle sind in der Lage, zelluläre Prozesse wie die Proliferation, Differenzierung und Apoptose zu steuern. Eine besondere Bedeutung kommt ihnen bei der Entstehung und Progression von Tumorerkrankungen zu, da sie sowohl als Onkogene als auch als Tumorsuppressoren fungieren können. In der urologischen Forschungsgruppe der Universität des Saarlandes konnte für das kNZK bei 14 miRNAs eine Expressionsänderung im Vergleich von metastasierten zu nichtmetasta-sierten Tumoren festgestellt werden. In dieser Arbeit wurde eine Validierung der veränderten miRNA-Expression retrospektiv an einem unabhängigen Patientenkollektiv vorgenommen. Die Validierung der beiden miRNAs miR-30e-3p und miR-139-5p an 48 nichtmetastasierten und 54 metastasierten Proben unter Verwendung der quantitativen Echtzeit-polymerase chain reaction (qPCR) stellte sich als erfolgreich heraus. Es konnte bestätigt werden, dass sowohl die Expression der miR-30e-3p als auch die miR-139-5p-Expression in metastasier-ten Tumoren im Vergleich zu nichtmetastasierten Tumoren höchst signifikant herunterregu-liert war. Zudem sollte die prognostische Aussagekraft der miRNAs durch eine Korrelation zu den kli-nischen Parametern geprüft werden. Hierbei konnte anhand von Kaplan-Meier-Analysen für die miR-30e-3p ein höchst und für die miR-139-5p ein hoch signifikanter Zusammenhang zwischen der miRNA-Expression und dem metastasierungsfreien Überleben bestätigt wer-den. Zusätzlich wurde die Korrelation zwischen der miRNA-Expression und dem Gesamt-überleben der Patienten geprüft. Für die beiden untersuchten miRNAs miR-30e-3p und miR-139-5p konnte jedoch kein signifikantes Ergebnis ermittelt werden. Auch bei den organ-begrenzten Tumoren der T-Kategorie pT1 und pT2 war eine verminderte Expression der bei-den miRNAs signifikant mit einem kürzeren metastasierungsfreien Überleben assoziiert. Um weitere Erkenntnisse über die Funktionen der miRNAs im Metastasierungsprozess zu erhalten, konnten in Vorversuchen der urologischen Forschungsgruppe mittels Proteomana-lysen potentielle miRNA-Targets für die miR-30a-3p identifiziert werden. Hierzu gehören die Proteine Cofilin und Nucleosid-Diphosphatkinase (NDK). Als ein weiteres Ziel dieser Arbeit sollten diese potentiellen Targets ebenfalls für die miR-30e-3p in Zellkulturmodellen der Zelllinie 786-O überprüft werden. Die Versuche erfolg-ten durch transiente Transfektion der miR-30e-3p und anschließenden Proteinnachweis durch Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE), Immundetektion und Western-Blot-Analysen. Die Auswertung der Ergebnisse zeigten einzeln betrachtet für die miR-30e-3p keine signifikant veränderten Proteinkonzentrationen von Cofilin oder NDK. Anschließend erfolgte eine Analyse der gesamten miR-30-Familie, welche Cofilin als poten-tielles Target bestätigen konnte. Die Ergebnisse dieser Arbeit bestätigen, dass die beiden miRNAs miR-30e-3p und miR-139-5p zur Vorhersage des Metastasierungsrisikos dienen können. Die individuelle Prognose kann somit genauer definiert werden als in den derzeit verwendeten klinischen prognostischen Scores.
Clear renal cell carcinoma (ccRCC) is the most frequent (about 80-90%) malignant tumor of the kidney. The prognosis depends strongly on the metastatic potential. Overall, approxi-mately 20% of patients show metastases at the time of the initial diagnosis, another 20% develop metachronous metastases. The 5-year survival rate in metastatic patients is approx-imately 10%. According to the current guidelines of 2017, adjuvant therapy is not recom-mended. In order to achieve an individual prognostic evaluation and an improvement in adju-vant therapy and aftercare in patients with metastatic ccRCC, reliable molecular markers are required. In recent years miRNAs represent very potent candidates. These small single-stranded RNA molecules are able to control cellular processes such as proliferation, differentiation and apoptosis. They are of particular importance in the develop-ment and progression of tumor diseases, because they can function both - as oncogene suppressors and as tumor suppressors. The urological research group at Saarland University has already been identified expression changes of 14 miRNAs in metastatic compared to non-metastatic tumors. In this thesis the altered miRNA expression in correlation with the metastatic potential is evaluated on an in-dependent group of patients retrospectively. The validation in 48 non-metastatic and 54 metastatic samples using the quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) confirmed that the expression of miR-30e-3p and miR-139-5p in metastatic tumors was significantly downregulated compared to non-metastatic tumors. In addition, the prognostic significance of the miRNAs has been tested by correlating with the clinical parameters. Kaplan-Meier analysis confirmed a highly significant correlation between miRNA expression of miR-30e-3p and miR-139-5p and metastases-free survival. Furthermore the correlation between miRNA expression and overall survival of pa-tients was examined. For the two miRNAs miR-30e-3p and miR-139-5p no significant result could be determined. A reduced expression of the two miRNAs was also significantly associ-ated with a shorter metastasis-free survival in organ-confined tumors of the T categories pT1 and pT2. In order to gain further insights into the functions of miRNAs in the metastatic process, poten-tial miRNA targets for miRNA miR-30a-3p have been identified in preliminary studies of the urological research group of Saarland University using proteome analysis - including the pro-teins cofilin and nucleoside diphosphate kinase (NDK). A further goal of this thesis was to prove these potential targets also for miR-30e-3p in cell culture models of cell line 786-O. The experiments were carried out by transient transfection of miR-30e-3p and subsequent protein detection by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), immune detection and western blot analysis. Results did not show any significant changes in protein concentrations of cofilin or NDK for the miR-30e-3p individually. This was followed by an analysis of the entire miR-30 family, which confirmed cofilin as a potential target. The results of this work confirm that the two miRNAs miR-30e-3p and miR-139-5p can be used to predict the risk of metastasis. The individual prognosis can thus be defined more precisely than in the currently used clinical prognostic scores.
Link to this record: urn:nbn:de:bsz:291--ds-284179
hdl:20.500.11880/27632
http://dx.doi.org/10.22028/D291-28417
Advisor: Junker, Kerstin
Date of oral examination: 27-Feb-2019
Date of registration: 9-Aug-2019
Faculty: M - Medizinische Fakultät
Department: M - Urologie und Kinderurologie
Professorship: 
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