Impact of cigarette smoking on DNA methylation levels and its influence on human sperm parameters

Abstract

Cigarette-smoking is still one of the most common habits worldwide. According to WHO, almost one-third of global populations above 15-years-old are smokers. Several of the previous studies have found a negative association between cigarette-smoking and standard semen parameters, sperm penetration, and fertilization capacity. Moreover, cigarette-smoking also produces changes in the epigenome, such as DNA methylation. DNA methylation plays a vital role in genome stability, imprinting genes, X-chromosome inactivation, and the regulation of gene transcription. The main aims of this present thesis can be summarized as the following: (I) to assess the variation in sperm DNA methylation levels between smokers as cases and non-smoker males as controls, as well as to study the association between the change in sperm DNA methylation patterns and sperm parameters in male smokers (II) to assess whether there is an alteration in the sperm DNA methylation levels between subfertile and proven fertile males; and furthermore, (III) to evaluate the correlation between changes in sperm DNA methylation levels and sperm parameters in subfertile males. Infinium 450K BeadChip arrays were used to recognize the alteration in the sperm DNA methylation levels between the various study groups (cases and controls). Deep bisulfite sequencing was therefore used to validate the results obtained from Infinium 450K BeadChip arrays. Following CpGs, cg00648582, cg0932376, cg19169023, cg23841288, cg27391564, cg19455396, and cg07869343) were subjected to bisulfite sequencing. The cg00648582, cg19169023, cg23841288, cg19455396, cg07869343 are located in the gene body and are related to PGAM5, TYRO3, PTPRN2, TAP2 and MAPK8IP3 genes respectively whereas the cg0932376, and cg2739156 are located in the intergenic regions. Only six CpGs showed a significant difference between the case and control groups. Moreover, when local deep bisulfite sequencing was applied, different CpG sites were obtained besides the target CpG* that resulted from the Infinium 450k beadchip array. The following CpG sites showed significant differences in the case group compared to control one. These sites are related to specific genes and were shown to be as follows: fifteen out of twenty-five CpG sites in a PGAM5 gene-related amplicon, three out of four CpG sites in a gene TYRO3-related amplicon, nine out of twelve CpG sites in a gene PTPRN2-related amplicon and six out of twenty-two CpG sites in gene MAPK8IP3-related amplicons. A significant difference was also observed in four out of five CpG sites adjacent to cg09432376, and seven out of fifteen CpG sites bordering the cg27391564-related amplicon. Moreover, a significant correlation was found between the variation in sperm DNA methylation levels and standard sperm parameters in the fertile male smokers, namely the case group. On the other hand, the variations between sperm DNA methylation levels among the proven fertile and subfertile were assessed as follows: the CpG sites (cg19779893, cg19406113, cg23081194, cg04807108, cg25750688, cg07227024, cg16338278, cg05799088, and cg08408433) were validated by deep sequencing where cg19779893, cg23081194, cg07227024, cg16338278, cg05799088, and cg0840843 were found to be located in the gene body of ADAMTS14, UBE2G2, ALS2CR12, ALDH3B2, PRICKLE2, and PTGIR genes respectively, and the three remaining cg19406113, cg04807108, and cg25750688 were located in the intergenic regions. When a local deep bisulfite sequencing was applied, different CpGs were detected close to the target CpGs* that resulted from the screening study. The following CpG sites showed significant differences in the case group compared to the control one. These sites are related to specific genes and were demonstrated as follows: three CpGs related to the ADAMTS14 gene, six out of eleven CpG sites related to cg19406113, three CpGs in the UBE2G2 gene, two CpG sites related to the cg25750688, and eight out of fifteen related to the cg04807108. In addition, two CpGs related to the PRICKLE2 gene, two CpGs related to the ALS2CR12 gene, seven CpGs related to the ALDH3B2 gene, and nine CpGs related to the PTGIR gene also demonstrated significant differences in the case groups compared to the control ones. Moreover, significant differences were also observed between the alterations in sperm DNA methylation levels in some CpGs adjacent to those afore-mentioned CpG sites and standard sperm parameters. In conclusion, this present study revealed biological differences in the DNA methylation levels of CpGs located in the gene body (cg00648582, cg19169023, cg23841288, cg19455396, cg07869343) and those located in the intergenic regions (cg0932376, and cg27391564). These alterations could potentially be related to the effects caused by smoking on the developmental stages of spermatozoa. In addition, a variation in sperm DNA methylation patterns between proven fertile and subfertile males was detected. Furthermore, an association between the changes in sperm DNA methylation and semen parameters was found in the case groups.

Zigarettenrauchen ist immer noch eines der häufigsten Gewohnheiten weltweit. Laut WHO sind fast ein Drittel der über 15-jährigen Raucher. Mehrere Studien fanden bereits eine negative Assoziation zwischen Zigarettenrauchen und Standard-Spermienparametern, Spermienpenetration und Befruchtungskapazität. Darüber hinaus führt Zigarettenrauchen auch zu Veränderungen im Epigenom und beeinträchtigt auch die DNA-Methylierung. Die DNA-Methylierung spielt eine entscheidende Rolle bei der Genomstabilität, der Prägung von Genen, der Inaktivierung von X-Chromosomen und der Regulation der Gentranskription. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war (I), die Variation der Spermien-DNA-Methylierungslevels zwischen Rauchern und Nichtrauchern (als Kontrollgruppe) zu untersuchen. Außerdem sollte der Zusammenhang zwischen Veränderungen der Spermien-DNA-Methylierungslevel und Spermienparameter bei männlichen Rauchern untersucht werden (II). Es sollte beurteilt werden, ob es eine Veränderung der Spermien-DNA-Methylierungslevel bei subfertilen und fertilen Männern gibt. Weiterhin sollte die Korrelation zwischen Veränderungen der Spermien-DNA-Methylierung und Spermienparametern bei subfertilen Männern untersucht werden. Infinium 450K BeadChip-Arrays wurden verwendet, um die Veränderung der Spermien- DNA-Methylierungslevel zwischen den verschiedenen Studiengruppen (Rauchern als Fallgruppe und Nichtrauchern als Kontrollgruppe) zu erkennen. Folglich wurde eine tiefe Bisulfitsequenzierung verwendet, um die Ergebnisse zu bestätigen, die von Infinium 450K BeadChip-Arrays erhalten wurden. Folgende CpGs wurden der Bisulfitsequenzierung unterzogen: cg00648582, cg0932376, cg19169023, cg23841288, cg27391564, cg19455396 und cg07869343). cg00648582, cg19169023, cg23841288, cg19455396, cg07869343, sind im Genkörper lokalisiert und mit PGAM5-, TYRO3-, PTPRN2-, TAP2- und MAPK8IP3-Genen assoziiert, während die cg0932376- und cg2739156-CpG stellen in den Bereichen zwischen den Genen lokalisiert sind. Nur sechs CpGs zeigten einen signifikanten Unterschied zwischen Fall- und Kontrollgruppe. Wenn lokale tiefe Bisulfit-Sequenzierung angewendet wurden, wurden außerdem verschiedene CpG-Stellen neben dem Ziel-CpG * erhalten, welches aus dem Infinium-450k-Beadchip-Array resultierte. Die folgenden CpG-Sites zeigten signifikante Unterschiede im Vergleich zu den Kontrollfällen. Sie sind mit spezifischen Genen verwandt und wurden wie folgt nachgewiesen: Fünfzehn von fünfundzwanzig CpG-Stellen in einem PGAM5-Gen-, drei von vier CpG-Stellen im TYRO3-, waren mit neun von zwölf CpG-Stellen in Gen-PTPRN2 und sechs von zweiundzwanzig CpG-Stellen in Gen-MAPK8IP3. Darüber hinaus wurde ein signifikanter Unterschied in vier von fünf CpG-Stellen von benachbart zu cg09432376 und sieben von fünfzehn CpG-Stellen, die dem cg27391564-verwandten Amplikon benachbart sind, beobachtet. Es wurde eine signifikante Korrelation zwischen der Variation des Spermien-DNA-Methylierungslevels und den Standard-Spermienparametern bei männlichen Rauchern (Fallgruppe) gefunden. Zusätzlich wurde die Variation der Spermien-DNA-Methylierungslevel zwischen den nachgewiesenen fertilen und subfertilen Proben beurteilt. Folgende CpG-Stellen (cg19779893, cg19406113, cg23081194, cg04807108, cg25750688, cg07227024, cg16338278, cg05799088 und cg08408433) wurden durch Tiefensequenzierung validiert. Es zeigte sich, dass cg19779893, cg23081194, cg07227024, cg16338278, cg05799088 und cg0840843 im Genkörper von ADAMTS14-, UBE2G2-, ALS2CR12-, ALDH3B2-, PRICKLE2- und PTGIR-Genen lokalisiert waren, und die drei verbleibenden cg19406113, cg04807108 und cg25750688 waren in Bereichen zwischen den Genen lokalisiert. Wenn eine lokale Tiefenbisulfitsequenzierung angewendet wurde, wurden verschiedene CpGs in der Nähe der Ziel-CpGs * nachgewiesen. Die folgenden CpG-Sites zeigten signifikante Unterschiede im Vergleich zur Kontrollgruppe. Diese Stellen sind mit spezifischen Genen verwandt und wurden wie folgt nachgewiesen: drei mit ADAMTS14-Gen verwandte CpGs, sechs von elf mit cg19406113 in Beziehung stehender CpG-Stelle, drei CpGs im UBE2G2-Gen, zwei mit cg25750688 verwandte CpG-Stellen und acht von fünfzehn verwandten cg04807108. Darüber hinaus zeigten zwei mit dem PRICKLE2-Gen verwandte CpGs, zwei mit ALS2CR12 verwandte CpGs, sieben mit dem ALDH3B2-Gen verwandte CpGs und neun mit dem PTGIR-Gen verwandte CpGs signifikante Unterschiede im Vergleich zur Kontrollgruppe. Darüber hinaus wurden signifikante Unterschiede zwischen Veränderungen der Spermien-DNA-Methylierungslevels in einigen CpG-Adjacents und den zuvor erwähnten CpG-Stellen, sowie den Standard-Spermienparametern beobachtet. Zusammenfassend wurden in der vorliegenden Arbeit biologische Unterschiede im DNA-Methylierungsgrad von CpGs im Genkörper (cg00648582, cg19169023, cg23841288, cg19455396, cg07869343) und in Bereichen zwischen den Genen (cg0932376 und cg27391564) gefunden. Diese Veränderungen könnten möglicherweise mit Auswirkungen des Rauchens auf die Entwicklungsstadien der Spermatozoen zusammenhängen. Zusätzlich wurde eine Variation in den Spermien-DNA-Methylierungsmustern zwischen fertilen und subfertilen Männern festgestellt. Darüber hinaus wurde in den Fallgruppen ein Zusammenhang zwischen den Veränderungen der Spermien-DNA-Methylierung und den Spermienparametern gefunden.