Bitte benutzen Sie diese Referenz, um auf diese Ressource zu verweisen: doi:10.22028/D291-27666
Titel: Regulation der kalzium Homöostase in Immunzellen und in Alzheimer-Modell Zelllinien
Verfasser: Miederer, Anna-Maria
Sprache: Deutsch
Erscheinungsjahr: 2017
Erscheinungsort: Homburg/Saar
SWD-Schlagwörter: Immunozyt
Freie Schlagwörter: Kalzium Homöostase
DDC-Sachgruppe: 610 Medizin, Gesundheit
Dokumentart : Dissertation
Kurzfassung: Ziel dieser Arbeit war es die Regulation von Kalziumsignalen genauer zu untersuchen und neue Gene zu identifizieren und charakterisieren die hierauf Einfluss haben. Ca2+ Signale regulieren genau kontrolliert verschiedene zelluläre Prozesse, wie u.a. Proliferation, Effektorfunktionen, Neurotransmitterabgabe oder Muskelkontraktionen. Dabei kann Ca2+ u.a. durch verschiedene Liganden-, speicher- oder spannungsgesteuerte Kanäle in die Zelle gelangen. In dieser Arbeit wurde ein neuer Regulator des speichergesteuerten Kalziumeinstroms (SOCE) identifiziert und charakterisiert. Bei STIM2.1, einer Spleißvariante des Kanal- Aktivators STIM2.2 (vorher STIM2), handelt es sich um eine um acht Aminosäuren längere Variante, die durch Retention und Translation eines zusätzlichen Exons entsteht. Bei dem hierdurch veränderten Bereich handelt es sich um die Kanal-aktivierende Domäne, der Interaktionsdomäne zwischen dem Aktivatorprotein und der Kanaluntereinheit Orai. Diagnostische PCRs und quantitative RT-PCRs zeigten, dass es sich bei STIM2.1 um eine ubiquitär exprimierte Variante handelt, wobei die höchste Expression im Vergleich zur konventionellen Variante STIM2.2 in unstimulierten T Zellen nachgewiesen wurde. Eine spleißspezifische siRNA Herunterregulation in CD4+ T Zellen enthüllte in Ca2+- Imaging Experimenten den inhibitorischen Effekt der neuen Spleißvariante auf SOCE. Eine heterologe Überexpression der Spleißvarianten zeigte, dass STIM2.1 im Gegensatz zu STIM2.2 nicht in der Lage ist die Kanalkomponenten Orai1 oder Orai2 zu aktivieren. Mit Hilfe von heterologen Koüberexpressionen in HEK-Orai1 stabilen Zelllinien wurde der dominant-negative Effekt von STIM2.1 sowohl auf STIM2.2 als auch auf STIM1 mediierten SOCE, sowie auf den endogenen SOCE in Jurkat T Zellen bestätigt. Anhand von FRET Analysen gelang es die fehlende Aktivierungsfähigkeit von STIM2.1 auf eine stark reduzierte Interaktion zwischen STIM2.1 und Orai1 zurückzuführen. Des Weiteren wurde mit beiden Spleißvarianten eine SILAC basierte Proteomanalyse zur Identifikation neuer STIM2 Interaktionspartner durchgeführt, um Regulatoren der STIM2 Funktion oder des speichergesteuerten Kalziumeinstroms zu finden. Dafür wurden Fusionskonstrukte aus STIM2.1 bzw. STIM2.2 mit APEX2 kloniert. Bei APEX2 handelt es sich um ein Enzym, das in Anwesenheit von H2O2 die Umwandlung von Biotin-Phenol in sein Radikal katalysiert, welches mit sich in der unmittelbaren Nähe befindenden Proteinen reagiert und so zur Biotinylierung dieser Proteine führt. Mittels Ca2+-Imaging, Westernblot Analyse und Immunzytochemie wurde sowohl die Funktionalität der STIM2-Konstrukte, als auch die lokal begrenzte Funktionalität von APEX2 bestätigt. Eine massenspektrometrische Analyse der biotinylierten Proteine ergab eine Reihe möglicher Hits, darunter je einen spleißspezifischen Hit. Die erfolgreich durchgeführte Proteomanalyse stellt einen guten Ausgangspunkt für eine zukünftige Validierung einiger der gefundenen Proteine als STIM2 Interaktionspartner dar. Der dritte Teil der Arbeit befasst sich mit neuronalem SOCE und dem spannunggesteuerten Kalziumeinstrom (VOCE) und dem Einfluss von APP und Präsenilin 1 auf diese beiden. Bei APP und Präsenilin 1 handelt es sich um Proteine, die vor allem im Bezug auf ihre Rolle in der Alzheimer Krankheit untersucht sind. Hier konnte gezeigt werden, dass eine Überexpression und ein Ausschalten von APP, ebenso wie ein Ausschalten von PS1 zu einem verringerten SOCE führt. Zudem erhöht der knock out von APP den spannungsgesteuerten Kalziumeinstrom, während die Überexpression von APP695 swedish diesen erniedrigte. qRT-PCR Daten sprechen dafür, dass Cav2.2 der hierfür verantwortliche Kanal ist. In PS1 knock out Zellen, die auch einen drastisch vergrößerten depolarisationsinduzierten Ca2+-Einstrom aufwiesen, konnten erhöhte relative mRNA Mengen von Cav2.2 und Cav3.1 gezeigt werden. Zusammengefasst gelang es in dieser Arbeit neue Regulationsmechanismen der Ca2+- Homöostase und hieran beteiligte Proteine zu identifizieren und charakterisieren. Zusätzlich wurde ein guter Ausgangspunkt für die Identifikation neuer STIM2 Interaktionspartner und somit möglichen weiteren Regulatoren der Ca2+-Homöostase geschaffen.
Changes in intracellular calcium play a essential role in many signaling pathways. As a second messenger it controls proliferation, differentiation, muscle contraction, neurotransmitter release but also cell death. The spatio-temporal pattern of these signals, restricted and defined in amplitude, kinetics and frequency is crucial to control the outcome on a cellular level. In this work new mechanisms to fine tune calcium signals via different calcium entry mechanisms were identified. The main calcium entry in non-excitable cells is store operated calcium entry (SOCE). We found that in addition to the known molecular players, Orai1, Orai2 and Orai3 as the pore forming channel subunits and STIM1 and STIM2 (now STIM2.2) as the channel activator, a STIM2 splice variant, STIM2.1, exists. The new variant is slightly longer (8 aa) due to the retention of an additional exon within the interaction domain of STIM and Orai. The ubiquitous expressed variant is highly conserved within mammals and comparatively equal expression levels in comparison to STIM2.2 were found in naïve CD4+ T cells. Ca2+ imaging experiments in these cells revealed that STIM2.1 influences calcium entry via Orai in a substantial and unexpected way. Splice specific siRNA knock down experiments prooved that, instead of being an activator as its homologues, STIM2.1 influences SOCE in a dominant negative way. Heterologous overexpression of the new splice variant showed that STIM2.1 by itself is not able to active Orai1 and that co-overexpression with its homologues revealed its inhibitory effect on STIM2.2- and STIM1-mediated SOCE. The decreased ability to interact with the channel component Orai1 was shown by FRET experiments. To further identify regulators of calcium signals, and SOCE more specifically, both STIM2 splice variants were used to perform a SILAC based proteomic screen using mass spectrometry to determine new interaction partners. Thereby APEX2, an engineered ascorbate peroxidase with the ability to initiate biotinylation of nearby proteins in the presence of biotin-phenol and H2O2, was cloned into the C-terminal variable region of STIM2.1 and STIM2.2. Western blot analysis and immunocytochemistry were used to confirm the local action of APEX2 and functionality of the assay. Mass spectrometry analysis revealed many potential interaction partners, amongst others one specific prediction for each splice variant. First steps to try to validate two candidates were taken but have to be followed up. Neuronal SOCE seems to be principally mediated by STIM2 that had been shown to be downregulated in Alzheimer’s disease (AD) and thereby aggravating the disease. Stable AD model cell lines with knock outs of the familiar AD associated genes APP or Presenilin 1 or overexpressing APP were used to identify the influence of these proteins on store operated and voltage gated calcium channels. Whereas effects on SOCE were relatively small striking differences were identified analyzing Cav channels. Knockout of APP and PS1 increases voltage operated calcium entry (VOCE) most likely through Cav2.2 and Cav2.2 and Cav3.1 respectively whereas the overexpression of APP695 swedish decreases VOCE in line with a decrease in relative mRNA level of Cav2.2. Altogether this works identified and characterized a new modulator of SOCE and shows that APP and PS1, genes related with familiar AD, influence calcium signals by modifying SOCE and VOCE. Furthermore a successful screen to identify new STIM2 interaction partners was performed and sets the foundation to investigate their impact in STIM2 function and calcium signaling.
Link zu diesem Datensatz: urn:nbn:de:bsz:291--ds-276663
hdl:20.500.11880/27313
http://dx.doi.org/10.22028/D291-27666
Erstgutachter: Niemeyer, Barbara
Tag der mündlichen Prüfung: 14-Dez-2017
SciDok-Publikation: 18-Jan-2019
Fakultät: M - Medizinische Fakultät
Fachrichtung: M - Biophysik
Fakultät / Institution:SciDok - Elektronische Dokumente der UdS

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