Bitte benutzen Sie diese Referenz, um auf diese Ressource zu verweisen: doi:10.22028/D291-27665
Titel: Validierung und Target-Identifizierung deregulierter microRNAs in Metastasen des klarzelligen Nierenzellkarzinom
Verfasser: Stolzenbach, Lara Franziska
Sprache: Deutsch
Erscheinungsjahr: 2017
Erscheinungsort: Homburg/Saar
SWD-Schlagwörter: miRNS
Nierenkrebs
Metastase
DDC-Sachgruppe: 610 Medizin, Gesundheit
Dokumentart : Dissertation
Kurzfassung: Die Prognose der Patienten mit einem klarzelligen Nierenzellkarzinom verschlechtert sich bei vorliegender Metastasierung drastisch. Auch neuartige zielgerichtete Systemtherapien und Immuntherapien führen äußerst selten zu einer kompletten Remission. Um neue effektive Therapieansätze und neue Prognoseparameter zu entwickeln, ist es notwendig, die molekularbiologischen Mechanismen der Metastasierung im klarzelligen Nierenzellkarzinom besser zu verstehen. MicroRNAs sind entscheidende Regulatoren diverser molekularbiologischer Prozesse. Vorrangegangene Untersuchungen konnten Expressionsunterschiede der microRNAs zwischen Primärtumoren und dem umliegenden Normalgewebe bestätigen. Mithilfe der Expressionsunterschiede und funktioneller Analysen konnte die Beteiligung von microRNAs an der Tumorgenese belegt werden. Wenig untersucht ist die microRNA Expression in den Metastasen. Die Vorergebnisse von Heinzelmann, Unrein et al. konnten diesbezüglich Unterschiede zwischen Primärtumoren und Lungen-, Knochen- und Gehirnmetastasen zeigen. Mittels Microarrayanalysen wurden microRNAs (insbesondere miR-30a-3p, miR-24-1-5p) identifiziert, welche an den Hauptmetastasierungsorten im Vergleich zu den Primärtumoren verändert exprimiert waren. Zusätzlich wurden an einzelnen Metastasierungsorten spezifische microRNA-Änderungen (unter anderem miR-200a-3p-Deregulation in Gehirnmetastasen) detektiert. Um die Metastasierungsprozesse besser zu verstehen, ist es das Ziel dieser Arbeit, auf Basis der Vorergebnisse die Genexpressionsunterschiede von miR-30a-3p, miR-24-1-5p und der miR-200a-3p in weiteren Tumor- und Metastasengeweben mittels quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction (qRT-PCR) zu validieren. Am Beispiel einer ausgewählten microRNA soll die Bedeutung für die Metastasierung mithilfe der Targetidentifizierung untersucht werden. Total-RNA wurde aus formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) Proben von metastasierten und nicht-metastasierten Primärtumoren des klarzelligen Nierenzellkarzinoms (n=28) und Fernmetastasen (n=29) aus Lunge, Gehirn und Knochen isoliert. Mittels qRT-PCR wurde die relative Genexpression der miR-30a-3p, miR-24-1-5p und miR-200a-3p ermittelt. Nach der Transienten Transfektion von miR-30a-3p in die Zelllinie 786-O wurden die potentiellen microRNA-Targets mittels Zwei-Dimensionaler-Gelelektrophorese identifiziert. Mithilfe des computerbasierten Vorhersage-Programmes GOmir und miRWalk wurden die komplementären Nukleotidsequenzen der potentiellen Targets für miR-30a-3p zusätzlich abgeglichen. Zunächst beinhaltet die vorliegende Arbeit den Nachweis einer spezifischen microRNA-Änderung an einem einzelnen Metastasierungsort. Die Expression der miR-200a-3p war reduziert in Gehirnmetastasen im Vergleich zu den nicht-metastasierten und metastasierten Primärtumoren (5,38-fach (p= 0,00024) /4,9-fach (p= 0,003)). MiR-200a-3p wurde in Gehirnmetastasen gegenüber der Knochenmetastasen um das 2,92-fache (p=0,003) und gegenüber der Lungenmetastasen um das 4,33-fache (p=0,003) reduziert exprimiert. Übereinstimmend mit dem Vorarbeiten war eine spezifische miRNA-Expressionsänderung für miR-200a-3p in Gehirnmetastasen reproduzierbar. Die ortsspezifische Expressionsänderung deutet auf Prozesse hin, die sich in den verschiedenen Metastasierungsorten unterscheiden. Weiterhin war eine generelle Expressionsveränderung von miR-30a-3p und miR-24-1-5p an den Hauptmetastasierungsorten zu überprüfen. Eine Expressionsänderung von miR-24-1-5p an den Hauptmetastasierungsorten (Gehirn, Lunge und Knochen) konnte mittels qRT-PCR nur teilweise bestätigt werden. Nur in Gehirnmetastasen zeigte sich ein deutlicher Expressionsunterschied im Vergleich zu den Primärtumoren und den Lungenmetastasen. Damit ist miR-24-1-5p am ehesten als eine microRNA anzusehen, die nicht in allen Hauptmetastasierungsorten verändert ist, sondern nur im Gehirn. Hingegen zeigte miR-30a-3p eine generelle Expressionsveränderung an den Hauptmetastasierungsorten. Die relative Genexpression von miR-30a-3p nahm im Vergleich zu den nicht-metastasierten klarzelligen Nierenzellkarzinom in dem metastasierten klarzelligen Nierenzellkarzinom um ein 1,99-faches (p=0,028), in den Knochenmetastasen um ein 4,08-faches (p=0,0005), in den Gehirnmetastasen um ein 8,13-faches (p=0,00005) und in den Lungenmetastasen um ein 2,62-faches (p=0,002) ab. Die generelle Expressionsänderung in den Hauptmetastasierungsorten im Vergleich zum Primärtumor deutet auf eine Beteiligung am Metastasierungsprozess hin. Die zusätzlich nachgewiesene Verminderung der miR-30a-3p im metastasierten Primärtumor lässt schlussfolgern, dass miR-30a-3p schon an den initialen Prozessen der Metastasierung beteiligt ist. Die identifizierten potentiellen miRNA-Targets der miR-30a-3p sprechen ebenfalls für diese These. Mithilfe der Zwei-dimensionalen Gelelektrophorese wurden die potentiellen Targets Alpha-Enolase, Galectin-1, Cofilin und Nukleosid-Diphosphat-kinase B identifiziert. Alpha-Enolase ist ein Enzym der Glykolyse und Glukoneogenese und dient als Energiequelle für Tumorzellen (WARBURG, 1956a). Die Ziel-mRNA, Galectin-1 ist in verschiedenen Signalwegen beschrieben, unter anderem in der Zelladhäsion und der Metastasierung. Cofilin und Nukleosid-Diphosphat-kinase B, sind am Signalweg des Aktinzytoskelettumbaus beteiligt und tragen zur Mobilität der Zellen bei. Die Mobilität von Tumorzellen ist ein essentieller Vorgang in der Metastasierung. Die vorliegenden Ergebnisse deuten erstmalig auf eine regulierende Funktion der miR-30a-3p an dem Signalweg des Cofilins hin. Damit scheint miR-30a-3p über Cofilin an der Metastasierung des klarzelligen Nierenzellkarzinoms beteiligt zu sein. Zusammenfassend leisten die verifizierten microRNA Expressionen und die identifizierten Targets einen Beitrag zum besseren Verständnis der Metastasierung des klarzelligen NZK. In Zukunft sollte geprüft werden, ob sich die untersuchten microRNAs als biologische Marker für den individuellen Krankheitsverlauf und die prognosebestimmende Metastasierung eignen
The prognosis of patients with a clear cell renal cell carcinoma drastically deteriorates due to metastasis. Even novel targeted therapy and immune therapy rarely achieves a complete remission. To develop new effective therapies and new prognostic factors, a better understanding of molecular mechanism of metastasis is necessary. MicroRNAs (miRNAs) are regulators of diverse molecular processes. Previous analyses could confirm alterations in miRNA expression between primary tumors und normal kidney tissue. MiRNA expression alterations and functional analyses confirmed a participation of miRNAs in tumorigenesis. Little is known about miRNA expression levels in metastases. Regarding to these preceding studies by Heinzelmann, Unrein et al. found miRNA alterations between primary tumors and of lung, bone and brain metastases. By microarray analyses, miRNAs (in particular miR-30a-3p, miR-24-1-5p) were identified, which were differentially expressed in metastases in comparison with primary tumors. Additionally there were specific miRNA alterations found at some metastasis locations (for example the dysregulation of miR-200a-3p in brain metastases). For a better understanding of metastasis processes, the aim of this study is to validate on the basis of the preceding study the gene expression alterations of miR-30a-3p, miR-24-1-5p and miR-200a-3p in other tissues of primary tumors and metastases by quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction (qRT-PCR). For one selected miRNA the correlation to the metastasis process shall be investigated by target identification. Total-RNA samples of metastatic and non-metastatic primary clear cell renal cell carcinoma (n=28) and metastases from lung, brain, bone (n=29) were isolated from formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) samples. The relative gene expression of miR-30a-3p, miR-24-1-5p and miR-200a-3p was investigated by qRT-PCR. After transient transfection of miR-30a-3p in cell line 786-O, targets were identified by two-dimensional gel electrophoresis. The nucleotide sequences of the potential targets of miR-30a-3p were compared by the computer-based prediction programs GOmir and miRWalk. At first this study treats the verification of a differently expressed miRNA in a single metastatic location. The gene expression of miR-200a-3p was found to be reduced in brain metastases compared to non-metastatic and metastatic primary tumors (5,38-fold (p= 0,00024) /4,9-fold (p= 0,003)). Furthermore miR-200a-3p was reduced expressed in brain metastasis compared to bone (2,92-fold (p=0,003)) and lung metastases (4,33-fold (p=0,003)). Concordantly to the preceding studies a specific miRNA expression alteration was confirmed. The specific local expression alterations indicate differences in the processes at different metastases locations. Furthermore a general expression alteration of miR-30a-3p and miR-24-1-5p in the distant metastases should be verified. An expression alteration of miR-24-1-5p in distant metastases (brain, lung and bones) could be partially confirmed by qRT-PCR. But in brain metastasis the expression is reduced compared to primary tumors and lung metastases. Therefore miR-24-1-5p is not regarded to be generally dysregulated miRNA in distant metastases, but rather as a dysregulated miRNA just in brain metastases. However, miR-30a-3p showed a general decrease of the expression in distant metastases. The relative gene expression of miR-30a-3p was found reduced in metastatic primary tumors (1,99-fold (p=0,028)), in brain metastases (8,13-faches (p=0,00005)), in lung metastases (2,62-faches (p=0,002)) and in bone metastases (4,08-faches (p=0,0005)) compared to non-metastatic primary tumor. The general expression alteration in the distant metastases shows that different processes between primary tumor and distant metastasis occur. These processes are supposed to be involved in the metastasis. Additionally the decrease of miR-30a-3p expression in metastatic primary tumor shows which miR-30a-3p is involved in the early steps of metastasis. The identified potential targets of miR-30a-3p support this thesis. By two-dimensional gel electrophoresis four targets, alpha-enolase, galectin-1 cofilin and nucleosid-diphosphate-kinase B were identified. Alpha-enolase is an enzyme of the glycolysis and gluconeogenesis and serves as energy source for tumor cells. The target galectin-1 is described in several signal pathways, amongst other in cell adhesion and in the metastasis. Two more microRNA-targets, cofilin and nucleosid-diphosphate-kinase B are involved in the signal pathway of actin cytoskeleton organization and contribute to cell mobility. Cell mobility is an essential event in metastasis. For the first time, the present study suggests a regulatory function of miR-30a-3p in the cofilin pathway. The verified miRNA expression alterations and the identified targets contribute to a better understanding of metastasis. In the future the investigated microRNAs shell be proved as biological markers for the individual follow-up prediction and for the metastasis prognosis.
Link zu diesem Datensatz: urn:nbn:de:bsz:291--ds-276651
hdl:20.500.11880/27312
http://dx.doi.org/10.22028/D291-27665
Erstgutachter: Junker, Kerstin
Tag der mündlichen Prüfung: 8-Jan-2018
SciDok-Publikation: 18-Jan-2019
Fakultät: M - Medizinische Fakultät
Fachrichtung: M - Urologie und Kinderurologie
Fakultät / Institution:SciDok - Elektronische Dokumente der UdS

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