Bitte benutzen Sie diese Referenz, um auf diese Ressource zu verweisen: doi:10.22028/D291-27635
Titel: Anreicherung einer aktivitätsabhängigen Splice-Variante von Dynamin 1 in Synapsen in verschiedenen Regionen des Zentralen Nervensystems
Verfasser: Eich, Marie-Lisa
Sprache: Deutsch
Erscheinungsjahr: 2017
Erscheinungsort: Homburg/Saar
SWD-Schlagwörter: Zentralnervensystem
Freie Schlagwörter: Dynamin 1
DDC-Sachgruppe: 610 Medizin, Gesundheit
Dokumentart : Dissertation
Kurzfassung: Dynamine sind GTP-bindende Mechanoenzyme, die an verschiedenen Formen der Endozytose und Vesikelabschnürung beteiligt sind. Es sind drei Dynamin-Gene (Dynamin1- 3) bekannt. Dynamine sind mit verschiedenen Splicevarianten an sehr unterschiedlichen Vorgängen in der Zelle beteiligt. Diese umfassen sowohl konstitutive als auch aktivitätsabhängige Prozesse. Nervenzellen besitzen einen besonders aktiven endozytotischen Membranverkehr, insbesondere in den präsynaptischen Terminalen. In den präsynaptischen Terminalen geschieht synaptische Kommunikation via Exozytose von Neurotransmitter-enthaltenden synaptischen Vesikeln, die nach der Fusion mit der präsynaptischen Plasmamembran wieder aufgenommen werden müssen. Die endozytotische Wiederaufnahme von Membranvesikeln muss dabei dynamisch an unterschiedliche Aktivitätszustände in der präsynaptischen Terminale angepasst werden. In der vorliegenden Arbeit habe ich eine spezielle, aktivitätsabhängige Splicevariante (Dynamin 1xb) von Dynamin 1, Dynamin 1xb, untersucht. Die Dynamin1 Splicevariante Dynamin1xb ist besonders interessant, da sie eine Bindungsstelle für die Ca2+-abhängige Phosphatase Calcineurin besitzt (Bodmer et al., 2011). Die Ca2+- und damit aktivitätsgesteuerte Phosphatase Calcineurin dephosphoryliert Dynamin1 und kann auf diese Weise Dynamin1 „anschalten“ bzw. in seiner Aktivität steigern. Diese Dynamin1xb-abhängige Form der Endozytose kann während starker neuronaler Stimulation beim Recyceln von synaptischen Vesikeln von großer Bedeutung sein. Im Rahmen dessen habe ich einen selbst hergestellten monoklonalen Antikörper (Anti-Dynamin 1xb (Klon 1E10)) gegen diese Ca2+- regulierte, aktivitätsabhängige Splicevariante von Dynamin 1 charakterisiert. Mit Hilfe des hergestellten monoklonalen Antikörpers, der spezifisch Dynamin1xb erkennt, konnte ich Dynamin 1xb mittels Western Blot in verschiedenen zentralnervösen Geweben nachweisen: Cerebellum, Neocortex, Rückenmark und Retina. Dynamin1xb war dagegen in nicht neuronalem Gewebe, wie Niere und Darm, abwesend, wie ich mittels Western-Blot- Untersuchungen gezeigt habe. Die Spezifität des Antikörpers wurde mithilfe von Präabsorptionsexperimenten gezeigt. Die Präabsorption des Antikörpers mit dem spezifischen Dynaminpeptid, gegen welches der Antikörper gerichtet ist, führte sowohl in Western Blot-Untersuchungen als auch in Immunfluoreszenzexperimenten zu einem Verschwinden des Immunsignals. Um Dynamin 1xb genau lokalisieren zu können, verwendete ich den hergestellten, Dynamin1xb-spezifischen monoklonalen Antikörper (Anti-Dynamin1xb (Klon 1E10)) in der Immunfluoreszenzmikroskopie (konventionelle Epifluoreszenzmikroskopie und Konfokalmikroskopie) und untersuchte mit dieser Methode verschiedene Gewebe. Dabei zeigte sich, dass Dynamin 1xb im Cerebellum, im Rückenmark und im visuellen Cortex in der grauen Substanz angereichert ist, und zwar dort, wo sich die Synapsen befinden. Die weiße Substanz zeigte im Vergleich dazu ein nur sehr schwach ausgeprägtes Dynamin 1xb Immunsignal. Dynamin 1xb wies in Cerebellum und visuellem Cortex außerdem ein ähnliches Expressionsmuster wie die synaptischen Vesikelproteine SV2 und Synaptotagmin 1 sowie das aktive Zonen-Protein RIM1/2 auf. In der Retina wurde Dynamin 1xb in den Ribbonsynapsen der Photorezeptoren und in der Synapsenschicht zwischen den Bipolarund Ganglienzellen nachgewiesen, welches durch Doppelimmunfluoreszenzinkubationen mit einem Protein der Ribbonsynapsen, RIBEYE, bestätigt wurde. In Photorezeptor- Ribbonsynapsen war das Dynamin 1xb Signal besonders stark in der peri-aktiven Zone in unmittelbarer Nachbarschaft zu den synaptischen Ribbons. Zusammenfassend wurde Dynamin 1xb in allen synaptischen Schichten aller ausgetesteten Abschnitte des ZNS (cerebellären und visuellen Cortex, graue Substanz des Rückenmarks, OPL und IPL der Retina) gefunden und ist dort wahrscheinlich an der aktivitäts-abhängigen, Ca2+-regulierten Endozytose beteiligt. Eine Beteiligung von Dynamin 1xb an der aktivitätsabhängigen Endozytose in der präsynaptischen Terminale wird auch durch vergleichende semiquantitative Untersuchungen synaptischer Dynamin 1xb Immunsignale an hell- und dunkel-adaptierten Netzhäuten der Mausretina weiter gestützt.
„The calcineurin-binding, activity-dependent splice variant dynamin 1xb is highly enriched in synapses in various regions of the central nervous system” Dynamins are GTP-binding mechanoenzymes involved in different types of endocytosis and vesicle scission. Three dynamin genes (dynamin 1-3) are known. Dynamins are with their different splice variants involved in different cellular processes. These include constitutive as well as activity-dependent processes. Neurons possess a particular active endocytotic membrane traffic, especially in the presynaptic terminals. In the presynaptic terminal synaptic communication via exocytosis of neurotransmitter-containing synaptic vesicles takes place. These vesicles need to be retrieved after fusion with the plasma membrane. Furthermore, endocytosis needs to be adopted to different levels of synaptic activity in the presynaptic terminal. In the present study, I examined a particular activity-dependent splice variant (dynamin 1xb) of dynamin 1. This dynamin 1xb splice variant is unique because it can directly interact with the calcium- and calmodulin-dependent phosphatase calcineurin (Bodmer, Ascaño, und Kuruvilla 2011). The calcium and therefore activity-dependent phosphatase calcineurin dephosphorylates dynamin 1 and is able to “turn on” dynamin 1 or to enhance its activity. This dynamin 1xb dependent endocytosis can have a strong impact on vesicle recycling during high levels of synaptic activity. For this purpose, I characterized a new mouse monoclonal antibody (anti-dynamin1xb (clone 1E10)) against this Ca2+- regulated, activity-dependent splice variant of dynamin 1. In parallel to localization analyses of dynamin 1xb in different neuronal tissue, I found in western blot experiments, that dynamin 1xb is highly expressed in cerebellum, neocortex, spinal cord, and retina. The antibody’s specificity was tested by performing pre-absorption experiments by incubating the dynamin peptide or a control peptide with the monoclonal antibody clone 1E10. Later on, pre-absorbed antibody was tested in western blot analyses and in immunofluorescence experiments where pre-absorbed antibody produced no signal. Furthermore specificity of antibody was confirmed by checking non-neuronal tissues like kidney and intestine where no immune reactivity was detected, when the dynamin 1xb antibody was preabsorbed with the dynamin peptide; while the immunoreactivity remained unchanged. To localize dynamin 1xb, I performed conventional epifluorescence microscopy and confocal microscopy. I found that dynamin 1xb is enriched in the grey matter of cerebellum, visual cortex and spinal cord, where synapses are localized. All three layers of the cerebellar cortex expressed dynamin 1xb. Markedly strong signals were detected in the cerebellar glomeruli of the granular layer. Likewise all layers of the visual cortex expressed dynamin 1xb. In spinal cord dynamin 1xb was highly enriched in the grey matter, equally distributed with synaptotagmin 1 and RIM 1/2, whereas tubulin was expressed in the grey and predominantly in the white matter. In contrast only a very weak dynamin 1xb immunosignal was detected in the fiber tracts of white matter of the cerebellum and spinal cord. Dynamin 1xb displayed a similar expression profile as the synaptic vesicle proteins SV2 and synaptotagmin 1 as well as the active zone protein RIM 1/2 in cerebellum and visual cortex. In retina dynamin 1xb was detectable in the outer and in the inner plexiform layer. In the photoreceptor ribbon synapses the dynamin 1xb signal was particularly strong in the periactive zone in close vicinity to the synaptic ribbons, proved by double immunofluorescence staining with RIBEYE. Taken together dynamin 1xb was found to be enriched in all layers of the cerebellar and the visual cortex, in the grey matter of the spinal cord, and in OPL and IPL of the retina playing a role in the activity-dependent, Ca2+-regulated endocytosis. An involvement of dynamin 1xb in activity-dependent endocytosis is further supported by semi quantitative evaluation of synaptic dynamin 1xb immunosignals between light- and darkadapted retinas.
Link zu diesem Datensatz: urn:nbn:de:bsz:291-scidok-ds-276350
hdl:20.500.11880/27284
http://dx.doi.org/10.22028/D291-27635
Erstgutachter: Schmitz, Frank
Tag der mündlichen Prüfung: 29-Jan-2018
SciDok-Publikation: 7-Jan-2019
Fakultät: M - Medizinische Fakultät
Fachrichtung: M - Anatomie und Zellbiologie
Fakultät / Institution:SciDok - Elektronische Dokumente der UdS

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