Steigerung profibrotischer Signaltransduktion unter arrhythmischer Stimulation in Kardiomyozyten

Abstract

Vorhofflimmern ist die häufigste Herzrhythmusstörung 1. Durch das Vorhofflimmern kommt es zu elektrischem und strukturellem Remodelling des Vorhofes. Das wichtigste Kennzeichen dieses strukturellen Remodellings ist die Fibrose. Die genaue Pathogenese der profibrotischen Signaltransduktion ist nicht vollständig bekannt. Viele Arbeiten konnten bereits zeigen, dass es durch Vorhofflimmern zu einer Verstärkung der profibrotischen Signaltransduktion kommt. Die besondere Bedeutung der Arrhythmie für diese Prozesse ist hingegen bisher nur teilweise erforscht. Daher entwickelten wir ein Zellkulturmodell mit neonatalen Rattenkardiomyozyten, um den singulären Einfluss der Arrhythmie auf die profibrotische Signaltransduktion weiter zu charakterisieren. Wir isolierten neonatale Kardiomyozyten aus Rattenherzen und stimulierten diese für 24 bzw. 48 Stunden in den Vergleichsgruppen rhythmisch und arrhythmisch, wobei beide Gruppen mit der gleichen Frequenz von 3Hz stimuliert wurden. Zunächst untersuchten wir den Connective Tissue Growth Factor (CTGF) als zentralen Mediator der Fibrose. Dabei zeigte sich bereits nach 24 Stunden unter arrhythmischer Stimulierung eine gesteigerte Proteinexpression auf 182±16%. Nach 48 Stunden Stimulation stieg diese Expression weiter auf 223±32%. In beiden Gruppen konnten wir keine Steigerung der CTGF Expression unter rhythmischer Stimulierung feststellen. Die 5´-AMP-aktivierte Kinase (AMPK), als Indikator für erhöhte energieverbrauchende Stoffwechselprozesse, war ebenfalls nach 24 und 48 Stunden arrhythmischer Stimulation auf 205±16% bzw. 192±21% erhöht. Des Weiteren konnten wir zeigen, dass es unter Arrhythmie und selektiver Ausschaltung der AMPK mit Compound C zu einer signifikanten Erniedrigung der CTGF Expression auf 83±10% kommt. Außerdem konnten wir zeigen, dass Arrhythmie zu einer signifikanten Steigerung der Expression von oxidativem Stress führt. Es zeigte sich eine Steigerung der Konzentration von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) auf 131±18%. Diese Erkenntnisse konnten wir durch eine Anfärbung des 8-oH-Desoxyguanosin untermauern. In dieser Färbung zeigte sich unter Arrhythmie eine deutlich stärkere Expression von 285±57%. Dem entgegen steht eine Aktivierung des antioxidativen Systems unter Arrhythmie. Es zeigte sich eine verstärkte Konzentration der Katalase mRNA von 119±6%. Außerdem waren die Konzentrationen der Superoxiddismutasen signifikant gesteigert. Nrf2, ein diesen Antioxidatien übergeordneter Transkriptionsfaktor, war in unseren Untersuchungen unter Arrhythmie nicht signifikant gesteigert. Als Verbindung zwischen oxidativem Stress und Fibrose zeigten wir, dass es zu einer Erhöhung von sST2 unter Arrhythmie kommt und somit die antifibrotischen Effekte von IL-33 und ST2L abgeschwächt werden. Fibrose äußert sich in einer Vermehrung der Extrazellulärmatrix (ECM). Dazu untersuchten wir die Parameter Kollagen I und III, Hyluronsäure und Hydroxyprolin als wichtigste Anteile dieser ECM. Dabei konnten wir keine signifikante Steigerung von Hyaluronsäure und Hydroxyprolin unter Arrhythmie feststellen. Kollagen I und III waren hingegen unter Arrhythmie sowohl nach 24 als auch nach 48 Stunden signifikant gesteigert. Arrhythmie führte zu einer Steigerung von Kollagen I nach 24 Stunden auf 317±70% und nach 48 Stunden auf 458±81%. Kollagen III war nach 24 Stunden unter Arrhythmie auf 218±61% und nach 48 Stunden auf 277±22% erhöht. Wir konnten somit eine Vermehrung der ECM auf Kollagenbasis unter Arrhythmie nachweisen. Alle aufgeführten Effekte waren signifikant mit p<0,05. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Arrhythmie zu einer profibrotischen Signaltransduktion führt. Durch eine erhöhte Expression von CTGF wird das strukturelle Remodelling entscheidend beeinflusst. Oxidativer Stress als Faktor, welcher CTGF beeinflusst, ist ebenfalls unter Arrhythmie erhöht. Diese Daten tragen zum zellulären Verständnis der Fibrogenese bei Vorhofflimmern bei.

Atrial fibrillation is the most common arrhythmia. Atrial fibrillation is associated with electrical and structural remodelling in the atria. The most important characteristic of the structural remodelling is fibrosis. The pathogenesis of the profibrotic signal transduction is incompletely understood. Atrial fibrillation is a major reason for enhancement of profibrotic signal transduction. The detailed role of arrhythmia for these processes is incompletely understood. We developed a cell culture modell with neonatal rat cardiomyocytes to characterize the singular influence of arrhythmia on profibrotic signal transduction. We isolated neonatal rat cardiomyocytes and stimulated them for 24 or 48 hours in groups of rhythmic and arrhythmic stimulation, whereas both groups were stimulated with same frequency of 3Hz. After 24 hours of arrhythmic stimulation there was an increased protein expression of Connective Tissue Growth Factor (CTGF) up to 182±16%. After 48 hours there was even an increase of expression of 223±32%. In both groups there was no increase of expression after rhythmic stimulation. The 5´-AMP-aktivierte Kinase (AMPK) as an indicator for energy-guzzling metabolic processes was also increased after 24 and 48 hours of arrhythmic stimulation on 205±16% or 192±21%. Furthermore we showed under selective suppression of AMPK with Compound C a significant suppression of CTGF expression on 83±10%. Moreover we showed that arrhythmia leads to significant increase of expression of oxidative stress. There was a significant increase of reactive oxygen species (ROS) concentration on 131±18%. We could confirm these results with the opacification of 8-oH-Desoxyguanosin. In this opacification there was a potentiation of its expression up to 285±57%. In contrast to that there was an increase in mRNA concentration of catalase on 119±6%. Moreover concentration of superoxiddismutase was significantly increased. Nrf2 as a transcriptional factor was not increased in our study. As a linking between oxidative stress and fibrosis we showed that there was an increase in sST2 due to arrhythmia which is the reason for the suppression of the antifibrotic effects of IL-33 and ST2L. We investigated collagen I and III, hyaluronic acid and hydroxyprolin as the most important amount of ECM. There was no significant increase of hyaluronic acid and hydroxyprolin after arrhythmia. Collagen I and III however were significantly increased after 24 or 48 hours of arrhythmia. Arrhythmia was the reason of the increase of collagen I on 317±70% after 24 hours and 458±81% after 48 hours. Collagen III was increased after 24 hours of arrhythmia on 218±61% and on 277±22% after 48 hours. In conclusion we could show a proliferation of ECM due to collagen increase after arrhythmia. All mentioned effects were significant wih p<0,05. In summary, arrhythmia plays a essential role in profibrotic signal transduction as part of atrial fibrillation. Due to increased expression of CTGF structural remodelling is crucially influenced. Oxidative stress as an influencer of CTGF is also increased. This profibrotic signal transduction identifies arrhythmia as an important factor for the proliferation of ECM as a characteristic of fibrosis.