Primary and immortalized murine alveolar epithelial cells as novel in vitro systems for preclinical studies

Abstract

To deliver drugs via the lungs, compounds must overcome the air-blood barrier, which is, inter alia, being tested in mice during early stage drug development. To help meet the 3R principle (‘refine, reduce replace’) and potentially reduce the number of mice used in this context, this study aimed at the generation of novel murine cell lines displaying features of the alveolar epithelium. As an initial step, reliable and efficient protocols for the isolation and cultivation of primary murine alveolar epithelial cells (mAEpC) were established. Like the human equivalent (hAEpC), mAEpC trans-differentiate in vitro from an alveolar epithelial type II (ATII) to an ATI-like phenotype and build a thin monolayer with high transepithelial electrical resistance (TEERmax ~1900 Ωcm²) when grown on permeable filter supports (Transwells®) demonstrating tight junction functionality. To generate cells with unlimited growth capacity, primary mAEpC from different mouse strains were lentivirally transduced with a library consisting of 33 bona fide proliferation-promoting genes. Upon the integration of certain genes in to the mAEpC genome, 10 genetically distinct mAELVi (murine alveolar epithelial lentivirus immortalized) cell populations could be expanded, of which the most promising ones – mAELVi.E and mAELVi.wt – were further characterized regarding their potential use in drug transport and inhalation toxicity studies.

Um eine gewünschte Wirkung über die pulmonale Route erzielen zu können, müssen potentielle Arzneistoffe die Blut-Luft-Schranke in der tiefen Lunge überqueren, was u.a. im Rahmen der frühen Medikamentenentwicklung an Tieren getestet wird. Unter Berücksichtigung des 3R-Prinzips (‚refine, reduce, replace‘) zielte diese Arbeit darauf ab, neuartige murine Zelllinien mit Eigenschaften des Alveolarepithels zu generieren, um dazu beizutragen die Zahl der in vorklinischen Studien eingesetzten Mäuse zukünftig reduzieren zu können. Hierfür wurden geeignete Methoden zur Isolation und Kultivierung primärer alveolarer Epithelzellen der Maus (mAEpC) etabliert. Diese trans-differenzieren in vitro und bilden eine dünne Schicht aus alveolaren Typ I-ähnlichen Epithelzellen mit hohem transepithelialen elektrischem Widerstand und folglich funktionalen ‚Tight Junctions‘. Um Zelllinien mit unbegrenzter Teilungsfähigkeit zu erhalten, wurden mAEpC mit Hilfe einer aus 33 lentiviralen Expressionsvektoren bestehenden Bibliothek verschiedener proliferationsfördernder Gene transduziert. Aufgrund der Lentivirus-vermittelten Integration potentieller Immortalisierungsgene in das mAEpC-Genom, entstanden 10 genetisch unterschiedliche, expandierbare mAELVi-Zellpopulationen (‚murine alveolare Epithelzellen Lentivirus-immortalisiert‘), deren Eignung als in vitro Systeme für vorklinische Studien anhand von Transport- und Zytotoxizitätsstudien im Rahmen der vorliegenden Arbeit untersucht und beurteilt wurde.