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Titel: Expression, calciumfluorimetrische und elektrophysiologische Untersuchung von TRPC6 in chromaffinen Nebennierenzellen von Mäusen
Verfasser: Büttner, Bastian Raphael
Sprache: Deutsch
Erscheinungsjahr: 2017
Erscheinungsort: Homburg/Saar
SWD-Schlagwörter: Protein TRPC6
Nebenniere
Maus
Chromaffine Zelle
DDC-Sachgruppe: 610 Medizin, Gesundheit
Dokumentart : Dissertation
Kurzfassung: Ein Anstieg in der intrazellulären freien Calciumionen-Konzentration ([Ca++]i) führt zu einer Freisetzung von Katecholaminen aus chromaffinen Nebennierenzellen in das Blut. Die Beteiligung spannungsabhängiger Calciumionenkanäle an der Katecholaminsekretion wurde in den vergangenen Jahren intensiv untersucht. Welche weiteren Ionenkanäle in chromaffinen Nebennierenzellen bei der Freisetzung von Katecholaminen eine Rolle spielen, ist jedoch noch größtenteils unbekannt. Die in meiner Arbeit dargestellten Experimente wurden an chromaffinen Nebennierenzellen durchgeführt, um eine Beteiligung von Transient Receptor Potential Canonical-Ionenkanälen Typ 6 (TRPC6) an der Calcium-Signalgebung chromaffiner Nebennierenzellen zu untersuchen. Chromaffine Nebennierenzellen sind zudem ein etabliertes Modell für neuronale Zellen, an dem die Katecholaminsekretion und die beteiligten Signaltransduktionskaskaden gut untersucht werden können. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte in chromaffinen Nebennierenzellen der Maus die Transkription und Expression von TRPC6 mittels Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) und Western Blot nachgewiesen werden. Der TRPC6-Ionenkanal ist ein calciumpermeabler Kationenkanal, der durch 1-Oleyl-2-acetyl-sn-glycerol (OAG), ein membrangängiges Analogon des Second messenger-Botenstoffes Diacylglycerol aktiviert werden kann. Ziel der vorliegenden Arbeit ist die erstmalige funktionelle Charakterisierung von TRPC6 in chromaffinen Nebennierenzellen von Mäusen, um so ein besseres Verständnis der Regulation physiologischer und pathophysiologischer Stressreaktionen zu erhalten. Zur funktionellen Charakterisierung von TRPC6 in chromaffinen Nebennierenzellen von Mäusen wurden Calcium-Imaging-Versuche durchgeführt. Als Positivkontrollen dienten Messungen an TRPC6 exprimierenden Human Embryonic Kidney-Zellen (HEK 293). 100 Sekunden nach Beginn der Messung erfolgte die Applikation von 100 μM OAG. Für diese Konzentration wurde eine deutliche Aktivierung von TRPC6-Kanälen beschrieben (Hofmann et al., 1999). 800 Sekunden nach Messbeginn wurde 500 μM Carbachol appliziert, mit dem Ziel, die Vitalität der untersuchten Zellen zu überprüfen. Sowohl HEK 293-Zellen, als auch chromaffine Nebennierenzellen exprimieren muskarinerge Acetylcholinrezeptoren, welche u.a. mittels Inositol-1,4,5-triphosphat (IP3) eine Calciumfreisetzung aus dem Endoplasmatischen Reticulum bewirken (Atwood et al., 2011; Huppelsberg und Walter, 2005; Garcia et al., 2006). Zudem sollte eine indirekte Aktivierung von TRPC6 untersucht werden. Die Stimulation von muskarinergen Acetylcholin-Rezeptoren mit der nachfolgenden Produktion von Diacylglycerol stellt einen möglichen physiologischen Aktivierungsweg von TRPC6, sowie einen physiologischen Aktivierungsweg von chromaffinen Nebennierenzellen dar (Huppelsberg und Walter, 2005). OAG induzierte einen signifikanten Calciumionen-Einstrom in TRPC6 überexprimierenden HEK 293-Zellen. Muskarinerge Stimulation mittels Carbachol führte zu einer sofortigen Zunahme der [Ca2+]i, wobei diese hauptsächlich durch eine Freisetzung von Calciumionen aus intrazellulären Speichern vermittelt wurde. In calciumfluorimetrischen Untersuchungen chromaffiner Nebennierenzellen in calciumhaltiger Badlösung zeigte sich eine oszillierende Zunahme der Fluoreszenz-Ratio nach Applikation von OAG als Zeichen einer Erhöhung der [Ca++]i. In calciumfreier Badlösung konnte im Gegensatz zu den o.g. Versuchen so gut wie keine Erhöhung der intrazellulären Calciumionen-Konzentration nachgewiesen werden. Dies weist darauf hin, dass die OAG- und Carbachol-vermittelte Calciumionen-Konzentrationserhöhung in chromaffinen Nebennierenzellen von Mäusen zum Großteil abhängig ist von extrazellulärem Calcium (Calcium-Einstrom; Calcium induced Calcium release). Kurz vor Beginn meiner Experimente wurde Hyperforin, ein Hauptwirkstoff des Johanniskrauts, als selektiver Agonist von TRPC6 beschrieben (Leuner et al., 2007). Damit erschien eine Differenzierung durch OAG ausgelöster Ströme in TRPC6- und TRPC3-/7-Stromanteile möglich. In whole cell Patch Clamp-Untersuchungen an stabil TRPC6 überexprimierenden HEK 293-Zellen wurde eine deutliche Stromzunahme bei Applikation von Hyperforin gemessen. Der induzierte Strom zeigte eine annähernd lineare Spannungsabhängigkeit und wies ein Umkehrpotential von etwa -10 mV auf. In calciumfreier Badlösung fehlte die Einstrom-Komponente fast vollständig. Zudem verschob sich das Umkehrpotential in negativere Bereiche. Die Stromzunahme konnte in gleicher Weise auch bei untransfizierten HEK 293-Zellen in calciumhaltiger oder calciumfreier Badlösung nachgewiesen werden, fiel hier jedoch nur halb so groß aus. Die Art des Stromes unterschied sich damit stark von den Strömen, welche bei Applikation von OAG bzw. Carbachol gemessen werden konnten (s.u.). Eine spezifische und alleinige Aktivierung von TRPC6 durch Hyperforin konnte somit nicht nachgewiesen werden. Aus diesem Grund erfolgten keine weiteren Messungen mit Hyperforin. Elektrophysiologische Untersuchungen an chromaffinen Nebennierenzellen im whole cell Patch Clamp-Verfahren sollten eine Charakterisierung des durch OAG und Carbachol ausgelösten Stromes ermöglichen. Zunächst wurden Messungen an stabil TRPC6 stabil überexprimierenden HEK293-Zellen durchgeführt („Positivkontrollen“). In den Versuchsreihen konnten TRPC6-spezifische Ströme bei Applikation von OAG und Carbachol nachgewiesen werden. Zudem zeigte sich, dass sich die in den Calcium-Imaging-Versuchen detektierte Zunahme der [Ca++]i mit der Aktivierung von TRPC6 deckt. Überraschender Weise konnte in den Messungen an chromaffinen Nebennierenzellen von Mäusen nach Applikation von OAG keinerlei Stromänderung gemessen werden. Durch die Applikation von Carbachol konnte lediglich ein kleiner, transienter, einwärts gerichteter Strom ausgelöst werden, ein TRPC6-typischer Strom konnte hingegen nicht gemessen werden. Aus diesem Grund erfolgten Messungen mit moduliertem Messprotokoll: 1.) Messung mit 0 mV Haltepotential zum Ausschluss einer Überlagerung eines TRPC6-Stroms durch spannungsabhängige Natrium- und Calcium-Ionenkanäle, 2.) Messung mit 10 mM CsCl enthaltender Badlösung zur Elimination des Einflusses von Kalium-Ionenkanälen auf das Messergebnis und 3.) Messungen mit nur 200 μM Calcium enthaltender Badlösung zur Verstärkung von TRPC6-Strömen. TRPC6 wird durch höhere Calciumionen-Konzentrationen gehemmt, bei niedrigen Calciumionen-Konzentrationen ist eine stärkere Aktivierung zu beobachten (Shi et al., 2004). Auch unter den modulierten Bedingungen waren jedoch keine TRPC6-typischen Ströme detektierbar. Weshalb keine zusätzlichen Ströme bei OAG- und keine TRPC3/-6/-7-typischen Ströme bei Carbachol-Applikation detektierbar waren, ist letztlich unklar. Weitere Untersuchungen könnten Aufschluss darüber geben, ob beispielsweise eine Koppelung an spannungsabhängige Calciumionen-Kanäle oder eine Hemmung durch Calmodulin zu o.g. Ergebnissen geführt hat.
A rise in intracellular free calcium ion concentration ([Ca++]i) leads to a release of catecholamines from adrenal chromaffin cells into the blood. The contribution of voltage-gated calcium channels has been intensively studied over the past years, whereas the contribution of other channel proteins in calcium signaling of chromaffin cells is mainly unknown. The experiments described in this dissertation were carried out with adrenal chromaffin cells to evaluate the contribution of classical transient receptor potential Ion channel 6 (TRPC6) in calcium signaling in adrenal chromaffin cells. Moreover chromaffin cells are a renowned model to study catecholamine secretion and the involved signal transduction cascades in neuronal cells. Within this work the transcription and expression of TRPC6 in mouse adrenal chromaffin cells could be proved, using reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) and western blot technique. The TRPC6 ion channel is a calcium-permeable cation channel which can be activated by 1-oleyl-2-acetyl-sn-glycerol (OAG), a membrane-permeable analogue of the second messenger diacylglycerol. The aim of this study was first-time functional investigation of TRPC6 in mouse adrenal chromaffin cells. The aim of this study is the first-time functional investigation of TRPC6 in mouse adrenal chromaffin cells in order to obtain a better understanding of the regulation of physiological and pathophysiological stress reactions. For the functional characterization of TRPC6 in mouse adrenal chromaffin cells, calcium imaging experiments were carried out. Positive controls were performed on human embryonic kidney (HEK 293) cells expressing TRPC6. 100 seconds after the start of the measurement 100μM OAG was applied. For this concentration, a clear activation of TRPC6 channels was described (Hofmann et al., 1999). After 800 seconds, 500 μM Carbachol was applied to check reagibility of the cells. Both HEK 293 cells and adrenal chromaffin cells express muscarinic acetylcholine receptors, which among others trigger calcium release from the endoplasmic reticulum via Inositol-1,4,5-triphosphate (Atwood et al., 2011; Huppelsberg and Walter, 2005; Garcia et al., 2006). In addition, an indirect activation of TRPC6 should be investigated. The stimulation of muscarinic acetylcholine receptors with the subsequent production of diacylglycerol represents a possible pathway of physiological activation of TRPC6, as well as a physiological pathway of activation of chromaffin-adrenal cells (Huppelsberg and Walter, 2005). OAG induced a significant calcium entry in TRPC6 overexpressing HEK 293 cells. Muscarinergic stimulation via Carbachol led to an immediate rise in [Ca++]i, mediated mainly by the release of calcium ions from intracellular stores. In calcium fluorimetric analyses mouse adrenal chromaffin cells showed a stable, oscillatory increase in fluorescence ratio (i.e. increase of intracellular calcium concentration) after application of OAG, when measured in calcium containing bath solution. In contrast to the above-mentioned analyses, in calcium-free bath solution almost no increase in intracellular calcium concentration could be detected. This indicates that the main part of the OAG- and Carbachol-mediated increase in [Ca++]i in mouse adrenal chromaffin cells is dependent on extracellular calcium (calcium influx; calcium induced calcium release). Shortly before the start of this study Hyperforin, a main constituent of St. John’s Worth was described to selectively activate of TRPC6 (Leuner et al., 2007). With this it seemed to be possible to differentiate OAG-activated currents into those carried out by TRPC6 and those carried out by TRPC3/-7. In whole cell patch clamp measurements with HEK 293 cells stably over-expressing TRPC6, a clear increase in current was observed when Hyperforin was applied. The induced current showed a nearly linear voltage dependency with a reverse potential of about -10 mV. In calcium-free bath solution, the inward component of the current was almost completely absent. In addition the reverse potential shifted to lower levels. The current increase could also be detected in the same way even in untransfected HEK 293 cells in calcium-containing or calcium-free bath solution, but here it was only half as large. The increase in current density could also be seen in untransfected HEK 293 cells, but was only half as large as seen in HEK 293 cells stably expressing TRPC6. The current thus differed strongly from the currents which could be measured under application of OAG or Carbachol (see below). A specific and sole activation of TRPC6 by Hyperforin could not be demonstrated. For this reason, no further measurements were performed with Hyperforin. Electrophysiological investigations on mouse adrenal chromaffin cells using the whole-cell patch clamp technique should help to characterize the currents elicited by application of OAG and Carbachol. First, measurements were made on HEK293 cells stably overexpressing TRPC6 ("positive controls"). TRPC6-specific currents were detected during the application of OAG and Carbachol. In addition, it could be shown, that the increase in [Ca ++] i in the Calcium imaging experiments matches with the activation of TRPC6. Surprisingly there was no change in current density detectable following application of OAG. The application of Carbachol only led to a small, transient inwardly directed current, but a current typical for TRPC6 could not be seen. For this reason, measurements were made with modulated measurement protocols: 1.) measurements at a holding potential of 0 mV to exclude an overlap of a TRPC6 current by voltage-dependent sodium and calcium ion channels, 2.) measurements with 10 mM CsCl-containing bath solution to eliminate the influence of potassium ion channels on the measurement result, and 3.) measurements with a bath solution containing only 200 μM calcium to amplificate TRPC6 currents. TRPC6 currents are inhibited by higher concentrations of calcium ions. At lower concentrations a higher activation of TRPC6 is observed (Shi et al., 2004). Even under the modulated conditions, however, no TRPC6-typical currents were detectable. It is unclear, why there were no currents typical for TRPC6 or TRPC3/-7 detectable. Further studies might elicit whether for example an interaction with voltage-gated calcium channels or with Calmodulin led to the above mentioned results.
Link zu diesem Datensatz: urn:nbn:de:bsz:291-scidok-ds-274119
hdl:20.500.11880/27203
http://dx.doi.org/10.22028/D291-27411
Erstgutachter: Bödding, Matthias
Tag der mündlichen Prüfung: 8-Nov-2017
SciDok-Publikation: 8-Nov-2018
Fakultät: M - Medizinische Fakultät
Fachrichtung: M - Experimentelle und Klinische Pharmakologie und Toxikologie
Fakultät / Institution:M - Medizinische Fakultät

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