Bitte benutzen Sie diese Referenz, um auf diese Ressource zu verweisen:
doi:10.22028/D291-27402
Titel: | Die Nikotinamid Nukleotid Transhydrogenase: Yin Yang der antioxidativen Kapazität in Kardiomyozyten |
VerfasserIn: | Graf von Hardenberg, Albrecht |
Sprache: | Deutsch |
Erscheinungsjahr: | 2017 |
Erscheinungsort: | Homburg/Saar |
Kontrollierte Schlagwörter: | Herzmuskelzelle |
Freie Schlagwörter: | Nikotinamid Nukleotid Transhydrogenase |
DDC-Sachgruppe: | 610 Medizin, Gesundheit |
Dokumenttyp: | Dissertation |
Abstract: | Hintergrund: Oxidativer Stress ist von großer Bedeutung für die Entstehung und
Progression einer Herzinsuffizienz und bezeichnet ein Ungleichgewicht zwischen
Produktion und Elimination von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS). Die wichtigsten
Quellen von ROS im Herzen sind die NADPH Oxidase (NOX) und Mitochondrien. Die
Mechanismen der mitochondrialen ROS-Emission sind unvollständig verstanden.
Die Nikotinamid Nukleotid Transhydrogenase (Nnt) katalysiert in Mitochondrien die
Reaktion NADH + NADP+ « NADPH + NADP+, und das Gleichgewicht der Reaktion
ist wegen ihrer Kopplung an den Protonengradienten über der inneren
Mitochondrienmembran zugunsten der NADPH Regeneration verschoben. In
Mitochondrien erhält NADPH die antioxidative Kapazität, damit kommt der Nnt in erster
Linie eine antioxidative Funktion zu. Eine häufig verwendete Mauslinie, die C57BL/6
Maus der Jackson Laboratories (BL/6J) weist eine Mutation auf, die zu einem
Funktionsverlust der Nnt führt, während die C57BL/6N Mauslinie über eine intakte Nnt
verfügt.
Ziel der Arbeit: Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Rolle der Nnt für die
antioxidative Kapazität in Herzmuskelzellen genauer zu charakterisieren. Es wurde die
Hypothese untersucht, ob ein Fehlen der Nnt zu vermehrten oxidativen Stress führt.
Hierfür wurden oben genannte Mausmodelle verwendet.
Methoden: Die Experimente wurden an isolierten Herzmuskelzellen und
homogenisiertem Myokard durchgeführt. Bei Experimenten an intakten
Herzmuskelzellen (Kardiomyozyten) wurde in diesen entweder die Autofluoreszenz
von NAD(P)H und FAD, oder alternativ das mitochondriale Membranpotential (ΔΨm)
mit TMRM zusammen mit zytosolischen Calcium-Konzentrationen (mit Indo-1), die
mitochondriale Superoxidproduktion (mit MitoSOX) oder die zelluläre H2O2
Akkumulation (mittels DCF) bestimmt. Darüber hinaus wurde die Sarkomerverkürzung
der Zellen während elektrischer Stimulation mit einer CCD-Kamera gemessen. Bei den
Experimenten an homogenisiertem Myokard wurde die Produktion von Superoxid mit
Lucigenin sowie die Autofluoreszenz von NAD(P)H bestimmt.
Ergebnisse: In isolierten Kardiomyozyten, die einer physiologischen Stimulation mit Anheben der Stimulationsfrequenz von 0.5 auf 5 Hz unter ß-adrenerger Stimulation
ausgesetzt wurden, traten keine Unterschiede zwischen BL/6J und BL/6N hinsichtlich
Sarkomerverkürzung, intrazellulärer Calcium-Konzentration, mitochondrialem
Membranpotential oder Superoxidproduktion auf. Allerdings kam es in BL/6J Mäusen
zu einer stärkeren Akkumulation von H2O2 (p<0,05), was ggf. auf das Fehlen der für
die antioxidative Kapazität benötigten Vorwärts-Reaktion der Nnt mit NADPHRegeneration
zurückzuführen ist. Während der Kalibrierung des NAD(P)H
Redoxstatus wurden -durch Applikation des Atmungsketten-Entkopplers FCCPBedingungen
simuliert, die zu einer selektiv erhöhten Arbeitslast durch Verbrauch von
NADH an der Atmungskette führen. Hierbei kam es zu einer stärkeren Oxidation des
gesamten NAD(P)H Pools in BL/6N als in den BL/6J Myozyten, was auf das Fehlen
des NADPH-Verbrauchs über die reverse Nnt Reaktion in BL/6J Myozyten
zurückgeführt wurde. Deshalb wurde in den BL/6J Myozyten nur der NADH-, aber nicht
der NADPH Pool verbraucht. In BL/6N Myozyten kam es hingegen durch die reverse
Nnt Reaktion nach Verbrauch von NADH über die Atmungskette auch zu einer
vollständigen Oxidation von NADPH. Als Positivkontrolle diente die Applikation von
H2O2, welches in beiden Genotypen die komplette Oxidation des NADH und NADPH
Pools verursachte. In homogenisiertem Myokard konnte die reverse Nnt Reaktion
durch Bedingungen reproduziert und quantifiziert werden, in denen die
Konzentrationen von NADPH und NAD+ hoch-, und von NADP+ und NADH niedrig
waren.
Schlussfolgerungen: Die bekannte antioxidative Rolle der Nnt, die durch ihre
Vorwärtsreaktion und NADPH Regeneration erklärt wird, konnte mit der Beobachtung
einer erhöhten H2O2 Detektion in Nnt-defizienten BL/6J Myozyten während
physiologischem Stress untermauert werden. Bei pathologischer Arbeitslast
überschreitet der NADH-Verbrauch an der Atmungskette die NADH-Regeneration im
Citratzyklus, und die resultierende NADH Netto-Oxidation provoziert die Umkehr der
Nnt Reaktion (NADPH + NAD+ ® NADH + NADP+), was NADPH Oxidation und
vermehrte H2O2 Emission herbeiführt.
Mit dieser überraschenden Erkenntnis über die reverse Nnt Reaktion bietet diese
Arbeit einen neuen zentralen pathophysiologischen Mechanismus der
Herzinsuffizienz, der oxidativen Stress durch eine erhöhte Arbeitslast erklärt. The nicotinamide nucleotide transhydrogenase: Yin Yang of antioxidative capacity in cardiomyocytes Background: Oxidative stress is causally linked to the onset and progression of heart failure and refers to an imbalance between production and elimination of reactive oxygen species (ROS). Important sources of ROS in the heart are the NADPH oxidase (NOX) and mitochondria. The mechanisms of mitochondrial ROS emission are incompletely resolved. In mitochondria, the nicotinamide nucleotide transhydrogenase (Nnt) catalyzes the reaction NADH + NADP+ « NADPH + NAD+. Through coupling to the proton gradient across the inner mitochondrial membrane, the equilibrium of this reaction shifts towards NADPH regeneration. Since NADPH maintains the antioxidative capacity in mitochondria, the Nnt has primarily an antioxidative function. A widely-used mouse strain, the C57BL/6 by Jackson laboratories (BL/6J) has a loss-of-function mutation of the Nnt, while the C57BL/6N strain has an intact Nnt. The aim of the thesis was to resolve the interplay between Nnt and antioxidative capacity. We hypothesized that Nnt deficiency triggers oxidative stress in cardiac myocytes. Methods: Experiments were performed on isolated cardiac myocytes and homogenated myocardium. In cardiac myocytes, the autofluorescence of NAD(P)H and FAD or alternatively, the mitochondrial membrane potential (ΔΨm; with TMRM) was determined together with cytosolic calcium concentrations (using Indo-1). In further experiments, mitochondrial superoxide production (via MitoSOX) or H2O2 accumulation (with DCF) were determined. Furthermore, sarcomere shortening during electrical stimulation was recorded by a CCD-camera. In experiments using homogenated myocardium, superoxide production was detected by lucigenin and the NAD(P)H redox state by its autofluorescence. Results: In isolated cardiac myocytes exposed to an increased stimulation frequency from 0.5 to 5 Hz under β-adrenergic stimulation, sarcomere shortening, intracellular calcium concentrations, mitochondrial membrane potential and superoxide production were similar between BL/6J and BL/6N myocytes. In contrast, H2O2 accumulation was more pronounced in Nnt-deficient BL/6J myocytes (p<0.05). This may be explained by the lack of NADPH regeneration by the Nnt which may deteriorate the antioxidative capacity. During the calibration of the NAD(P)H redox state, conditions of a selective increase of workload by consumption of NADH via the electron transport chain (ETC) are simulated via applications of the ETC uncoupler FCCP. During this condition, a more pronounced oxidation of the NAD(P)H pool in BL/6N versus BL/6J myocytes was observed, explained by the missing NADPH consumption via the reverse Nnt reaction in BL/6J. Therefore, only NADH, but not NADPH were oxidized. In contrast, in the BL/6N myocytes, NADPH is converted to NADH while NADH is consumed by the ETC. As a positive control, exogenous H2O2 oxidized both NADH and NADPH in both mouse strains. In homogenized myocardium, the reverse mode of the Nnt was quantified by NADH regeneration in the presence of high NADPH and NAD+ concentrations. Conclusions: During a physiological increase in workload, the Krebs cycle regenerates sufficient amounts of NADH to support the forward reaction of the Nnt, which regenerates NADPH which in run fuels the anti-oxidative capacity to eliminate H2O2. In contrast, during pathological workload, excessive oxidation of NADH provokes the reversal of the Nnt reaction, which then regenerates NADH from NADPH and thereby, depletes the antioxidative capacity. With this surprising finding of the reverse Nnt mode, this work identifies a novel and possibly central pathophysiological mechanism for heart failure, which could explain the onset of oxidative stress during a pathological increase of workload. |
Link zu diesem Datensatz: | urn:nbn:de:bsz:291-scidok-ds-274020 hdl:20.500.11880/27194 http://dx.doi.org/10.22028/D291-27402 |
Erstgutachter: | Maack, Christoph |
Tag der mündlichen Prüfung: | 20-Okt-2017 |
Datum des Eintrags: | 6-Nov-2018 |
Fakultät: | M - Medizinische Fakultät |
Fachrichtung: | M - Innere Medizin |
Sammlung: | SciDok - Der Wissenschaftsserver der Universität des Saarlandes |
Dateien zu diesem Datensatz:
Datei | Beschreibung | Größe | Format | |
---|---|---|---|---|
Die Nikotinamid Nukleotid Transhydrogenase.pdf | 3,4 MB | Adobe PDF | Öffnen/Anzeigen |
Alle Ressourcen in diesem Repository sind urheberrechtlich geschützt.