Bitte benutzen Sie diese Referenz, um auf diese Ressource zu verweisen: doi:10.22028/D291-27214
Titel: Die Rolle der neuronalen p38α Mitogen-aktivierten Proteinkinase in der Alzheimer-Krankheit
Verfasser: Schnöder, Laura
Sprache: Deutsch
Erscheinungsjahr: 2017
Erscheinungsort: Homburg/Saar
SWD-Schlagwörter: Alzheimerkrankheit
DDC-Sachgruppe: 610 Medizin, Gesundheit
Dokumentart : Dissertation
Kurzfassung: Die Rolle der neuronalen p38α-Mitogen-aktivierten Proteinkinase in der Alzheimer-Krankheit Die Alzheimer-Krankheit ist eine neurodegenerative Erkrankung und Hauptur-sache für Demenz. Bis heute gibt es keine Medikation, um die Patienten in ei-ner stetig alternden Gesellschaft zu heilen. Das Amyloid beta Peptid (Aβ) gilt als Schlüsselmolekül der Alzheimer-Pathogenese und Initiator der Tau-Ablagerun-gen. Aβ wird von den Enzymen β- und y-Sekretase synthetisiert und lagert sich im Gehirn zu neurotoxische Plaques ab. Dies resultiert im Absterben der Ner-venzellen, was wiederum zu typischen klinischen Symptomen wie Gedächtnis-verlust und kognitiven Defiziten führen kann. Die Mitogen-aktivierte Proteinkina-se p38 (p38-MAPK) wird mit dem entzündungsauslösenden Aβ sowie hyper-phosphoryliertem Tau in Verbindung gebracht. Eine erhöhte Menge an p38-MAPK wurde zusammen mit Aβ-Plaques in humanem Alzheimergewebe gefun-den und in vitro Studien belegen, dass eine Inhibition von p38-MAPK das Aβ-induzierte Absterben der Nervenzellen verringert. Von größtem Interesse ist es daher, die Auswirkung einer p38-MAPK Inhibition auf die Alzheimer-Pathogene-se zu untersuchen. Durch diese essentielle Forschung werden Informationen über das Zusammenspiel von Aβ-Synthese und p38-MAPK gewonnen, wodurch neue Therapieansätze entwickelt werden können. In der hier vorgestellten Stu-die wurde das, im Hirn stark exprimierte, α-Isoform der p38-MAPK in SHSY5Y Zellen sowie in Neuronen von APP/PS1tg Mäusen pharmakologisch bzw. gene-tisch reduziert. Nach dieser Reduktion, konnte sowohl in vitro als auch in vivo, mittels Immunhistochemie sowie quantitativem Western blot und Fluoreszenz-basierter Enzymaktivitätsmessungen festgestellt werden, dass sich der Aβ-Gehalt, sowie das Proteinlevel und die Enzymaktivität von BACE signifikant ver-ringern und gleichzeitig die Autophagie erhöht wird. Des Weitern zeigen in vitro Experimente, dass nach Transfektion von SHSY5Y Zellen mit dem p38α-MAPK knock down Konstrukt, BACE schneller über den lysosomalen Degradations-weg abgebaut wird. Kontrollexperimente mit neuronalen Primärkulturen bele-gen, dass die BACE Degradation durch das Autophagie-assoziierte Gen 5 (ATG5) vermittelt ist und der Effekt einer p38α-MAPK Reduktion nach ATG5 Inhibition wird partiell aufgehoben. Analysen mittels qRT-PCR in vitro und in vivo, zeigen hingegen keine reduzierte Genexpression von BACE nach Deletion von p38α-MAPK. Dies lässt auf post-transkriptionale Modifikationen an BACE nach p38α-MAPK Reduktion schließen. Eine post-translationale Modifikation an Serin über Phosphorylierung durch p38α-MAPK konnte nach Co-Immuno-präzipitation im BACE Zelllysat ausgeschlossen werden. Allerdings nimmt die p38α-MAPK über Phosphorylierung von MGAT3, einer N-acetylglucosa-minyltransferase-3, an Threonin indirekt Einfluss auf den Glykosylierungsstatus von BACE. In vivo-Studien (Kizuka et al., 2015a; Kizuka et al., 2016) belegen bei verminderter MGAT3 Aktivität, eine instabile Form von BACE und Degrada-tion in Lysosomen. Mittels der CRISPR-Cas9 gene editing Technologie wurde die MGAT3 Expression in SHSY5Y Zellen über liposomale Transfektion redu-ziert und die Effizienz nach durchflusszytometrischer Analysen ermittelt. Über-einstimmend mit aktuellen Studien, reduziert der MGAT3 knock down ebenfalls den Proteingehalt von BACE. Zusätzlich wurde in diesen Zellen p38α-MAPK deletiert. Quantitative Western blot Analysen zeigen, einen von p38α-MAPK-dosisabhänigen Umkehreffekt in den MGAT3 knock down Zellen, welcher in erhöhtem BACE Proteinlevel resultiert. Um den Phänotyp der Alzheimer-Krankheit zu vervollständigen wurde der Effekt einer genetischen p38α-MAPK Deletion in 9 Monaten alten APP/PS1tg und Tautg Mäusen auf Gedächtnis- und Lernprozesse mittels Morris water maze überprüft. Eine homozygote p38α-MAPK Deletion konnte die Lern- und Gedächtnisleistung, sowie die synaptische Integrität signifikant verbessern. Nach Anwendung einer TUNEL-Färbung konn-te erhöhte Apoptose als Nebeneffekt ausgeschlossen werden. Zudem konnte mittels qRT-PCR ein erhöhtes Expressionsprofil von Wachstumsfaktoren bei gleichzeitiger Reduktion der proinflammatorischen Zytokine wie TNF-α mit as-soziierter Reduktion von Mikroglia gezeigt werden. Zusammenfassend wirkt sich eine p38α-MAPK Reduktion positiv auf die Aβ und Tau-induzierte Alzhei-mer-Pathogenese aus. Als molekularer Mechanismus wurde, neben der gestei-gerten Autophagie und der damit verbundenen BACE Degradation, die indirekte Beeinflussung von p38α-MAPK auf die Glykosylierung von BACE, über Phos-phorylierung des zuständigen Glykoproteins MGAT3, und die dadurch resultier-te Instabilisierung identifiziert. Daher scheint eine spezifische Inhibition von p38α-MAPK als neue klinische Alzheimer-Therapie erfolgversprechend.
Pathogenic role of neuronal p38α mitogen activated protein kinase in Alz-heimer’s disease Alzheimer´s disease is a neurodegenerative disease and main cause of demen-tia. Until today, there is no efficient therapy to cure the patients of a continuous-ly altering population. The amyloid beta peptide (Aβ) is a key molecule in Alz-heimer´s pathogenesis and initiates aggregation of hyperphosphorylated tau. Aβ is produced by cleavage of two enzymes, the β- and y-secretase and accu-mulates in the brain to toxic plaques. This results in neurodegeneration, which in turn leads to Alzheimer´s disease typical symptoms like deficits in memory and cognitive function. The mitogen activated protein kinase p38 (p38-MAPK) is associated with neuroinflammatory Aβ and hyperphosphorylated tau. Increased amount of p38-MAPK was observed in human Alzheimer´s disease brain to-gether with Aβ plaques and in vitro studies showed a reduction of Aβ induced neuronal death after inhibition of p38-MAPK. Therefore the examination of the influence of p38-MAPK inhibition, on the Alzheimer´s disease pathogenesis is of major interest. Thus new information about the interaction between p38-MAPK and the synthesis of Aβ can help to create new therapeutic strategies for Alz-heimer´s disease patients. To gain insight in this research topic, this presented study was performed. The α isoform of p38-MAPK is highly expressed in brain, therefore we reduced the expression level of p38α-MAPK in SHSY5Y cells and in neurons of APP/PS1tg mice, by a pharmacological and a genetical approach, respectively. After this reduction a significant reduced Aβ load and protein level and activity of BACE was observed in vitro and in vivo after performance of im-munohistochemistry, quantitative Western blot and fluorescence based enzyme activity measurements. Simultaneously, autophagy was enhanced in both sys-tems. Moreover, in vitro experiments showed facilitated lysosomal BACE deg-radation, after transfection of SHSY5Y cells with the p38α-MAPK knock down construct. Control experiments verified that BACE degradation is mediated by autophagy related gene 5 (ATG5) and inhibition of ATG5 partially abolished the effect of p38α-MAPK reduction regarding the protein level of BACE. In contrast, no decrease of BACE gene transcription was observed after reduction of p38α-MAPK in vitro und in vivo by performing qRT-PCR analysis. These results indicated that post translational modifications on BACE occur after p38α-MAPK reduction, although the phosphorylation at serine by p38α-MAPK could be ex-cluded as post trancriptional modification after co-immunoprectipitation analysis in the BACE pull down lysate. However, by phosphorylation of the N-acetylglucosaminyltransferase-3 (MGAT3) at threonine, p38α-MAPK can indi-rectly influence the glycosylation level of BACE. Other studies provide evidence, that without glycosylation, BACE shows an instable form and will be degraded by the lysosomal pathway (Kizuka et al., 2015a; Kizuka et al., 2016). Applying the new gene editing technique of CRISPR-Cas9, MGAT3 expression was re-duced by liposomal transfection, in SHSY5Y cells. The transfection efficiency was verified by flow cytometric analysis. In line with recent studies, these MGAT3 knock down cells also showed reduced BACE protein level. In addition these cells were transfected with the construct for p38α-MAPK knock down. Quantitative Western blot analysis showed a rescue effect of reduced BACE protein level after p38α-MAPK reduction in MGAT3 knock down cells, which leads to increased BACE protein level. In order to complete the human Alz-heimer´s disease phenotype with Aβ and hyperphosphorylated tau, the cogni-tive performance of nine month old APP/PS1tg and Tautg mice, was analyzed by Morris water maze test after p38α-MAPK deletion respectively. Homozygote deletion of p38α-MAPK could improve learning and memory function and also the synaptic integrity was significant improved, in brain homogenates of these animals. Side effects like enhanced apoptosis after p38α-MAPK deletion could be excluded by quantitative Western blot and TUNEL assay. In addition, a high-er gene expression profile of growth factors in accordance with reduced gene expression profiles of pro inflammatory cytokines like TNF-α and reduced num-ber of microglia could be detected after p38α-MAPK knock out. In conclusion this study shows that a p38α-MAPK reduction acts positively on Aβ and tau in-duced Alzheimer´s disease pathogenesis. Beside facilitated BACE degradation due to increased autophagy, the indirect influence of p38α-MAPK at glycosyla-tion of BACE, by phosphorylation of the regarding glycoprotein MGAT3 and the resulting enhanced destabilization of BACE could be identified as underlying molecular mechanism. Therefore, a specific inhibition of p38α-MAPK is a prom-ising target for new Alzheimer´s disease treatments.
Link zu diesem Datensatz: urn:nbn:de:bsz:291-scidok-ds-272142
hdl:20.500.11880/27060
http://dx.doi.org/10.22028/D291-27214
Erstgutachter: Kirchhoff, Frank
Tag der mündlichen Prüfung: 25-Sep-2017
SciDok-Publikation: 4-Jun-2018
Fakultät: M - Medizinische Fakultät
Fachrichtung: M - Neurologie und Psychiatrie
Fakultät / Institution:M - Medizinische Fakultät

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